Frakcjonowanie izotopowe, wzbogacanie jednego izotopu względem drugiego w procesie chemicznym lub fizycznym. Dwa izotopy danego pierwiastka różnią się masą, ale nie właściwościami chemicznymi brutto, które są określane przez liczbę elektronów. Jednak subtelne efekty chemiczne wynikają z różnicy masy izotopów. Izotopy danego pierwiastka mogą mieć nieco inne stałe równowagi dla danej reakcji chemicznej, tak że z reagentów zawierających różne izotopy powstają nieco inne ilości produktów reakcji. Prowadzi to do frakcjonowania izotopowego, którego zakres można wyrazić za pomocą współczynnika frakcjonowania, alfa (α), zwanego również współczynnikiem rozdzielenia lub współczynnikiem wzbogacenia. Współczynnik ten jest stosunkiem stężeń dwóch izotopów w jednym związku podzielonym przez stosunek w drugim związku. Jeżeli Nl i Nh oznaczają względne obfitości lekkich i ciężkich izotopów, odpowiednio, w oryginalnym związku i jeżeli nl i nh są odpowiednimi obfitościami w nowym związku, to α = (Nl/Nh)/(nl/nh). Współczynnik frakcjonowania to współczynnik, o jaki zmieni się stosunek liczebności dwóch izotopów podczas reakcji chemicznej lub procesu fizycznego.
Wytrącanie węglanu wapnia z wody jest przykładem procesu frakcjonowania równowagowego. Podczas tego wytrącania tlen-18 jest wzbogacony o współczynnik 2,5 procent w stosunku do lżejszego, bardziej powszechnego izotopu tlenu-16; współczynnik frakcjonowania zależy od temperatury i w konsekwencji może być użyty jako środek do określenia temperatury wody, w której zachodzi wytrącanie. Jest to podstawa tzw. geotermometru izotopowego tlenu.
W procesie fotosyntezy węgiel-12, najpospolitszy izotop węgla, ulega dalszemu wzbogaceniu w stosunku do cięższego izotopu, węgla-13; celuloza i lignina w drewnie drzew jest w tym procesie wzbogacana o współczynnik około 2,5 procent. Frakcjonowanie w tym przypadku nie jest procesem równowagowym, ale raczej efektem kinetycznym: lżejszy izotop przechodzi szybciej przez proces fotosyntezy i w konsekwencji jest wzbogacony.
Procesy fizyczne, takie jak parowanie i kondensacja oraz dyfuzja termiczna, mogą również powodować znaczące frakcjonowanie. Na przykład tlen-16 jest wzbogacony w stosunku do cięższych izotopów tlenu w wodzie wyparowującej z morza. Z drugiej strony, wszelkie osady są wzbogacone w cięższy izotop, co powoduje dalszą koncentrację tlenu-16 w atmosferycznej parze wodnej. Ponieważ procesy parowania i kondensacji zachodzą zwykle odpowiednio w regionach równikowych i polarnych, śnieg w regionach polarnych jest obecnie zubożony w tlen-18 o około 5 procent w porównaniu z otaczającym go oceanem. Ponieważ stosunek izotopów tlenu w opadach jest wrażliwy na niewielkie zmiany temperatury w czasie osadzania, pomiary polarnych rdzeni lodowych są przydatne w badaniu zmian klimatu.
Rozszczepialny izotop uranu-235 został oddzielony od bardziej obfitego, nierozszczepialnego izotopu uranu-238 poprzez wykorzystanie niewielkiej różnicy w szybkości, z jaką gazowe sześciofluorki tych dwóch izotopów przechodzą przez porowatą barierę.
.