Wyniki i dyskusja
Dwa sposoby rozszczepiania DNA przez R.KpnI w obecności Mg2+.
R.KpnI jest wysoce promiskuityczną REazą w reakcjach katalizowanych przez Mg2+ w przeciwieństwie do większości innych REaz (11, 12). Na Rys. 1 A przedstawiono charakterystyczny wzór rozszczepiania przez R.KpnI w zakresie stężeń Mg2+. Przy niższych stężeniach jonu metalu (50-500 μM) obserwowano jedynie rozszczepienie sekwencji kognatycznej (pasy 2-5). Natomiast w stężeniach Mg2+ >500 μM obserwowano rozszczepienie promiskuityczne (pasy 6-9). Specyficzny i promiskuityczny sposób rozszczepiania przez R.KpnI w zależności od stężenia Mg2+ potwierdzono analizą rozszczepiania oligonukleotydów. Substrat oligonukleotydowy zawierający sekwencję kanoniczną był wydajnie rozszczepiany przez R.KpnI już przy 20 μM Mg2+. Natomiast sekwencje niekanoniczne były wydajnie rozszczepiane dopiero przy >500 μM Mg2+ . Wyniki te sugerują, że R.KpnI wykazuje dwa różne profile aktywacji metalami – jeden dla kanonicznych, a drugi dla niekanonicznych substratów DNA. Enzym wykazuje hiperboliczny profil aktywacji metalu dla kanonicznego substratu i sigmoidalny dla niekanonicznego substratu (Rys. 1 B). Dane te zostały poddane analizie Hill plot (Fig. S2; i patrz SI Text ), a współczynnik Hilla dla wiązania jonów metali jest przedstawiony w Tabeli 1. Analiza Hill plot ujawniła wiązanie dodatkowego jonu metalu do enzymu i jego rolę w rozszczepianiu sekwencji niekanonicznych. Tak więc, rekrutacja dodatkowego jonu metalu w pobliżu lub daleko od miejsca aktywnego enzymu wydaje się być konieczna do indukowania promiskuitycznego rozszczepiania przez enzym. Jeśli tak jest, to mutacja reszt zaangażowanych w koordynację jonów metali w drugim miejscu powinna znieść aktywność promiskuityczną, dając w efekcie enzym wysoce specyficzny sekwencyjnie. Przetestowaliśmy tę hipotezę.