Barwienie immunologiczne wykorzystuje przeciwciała do wykrywania antygenu w komórkach lub tkankach. Główną zaletą barwienia immunologicznego w immunohistochemii (IHC) jest możliwość zobaczenia pożądanego celu w próbce tkanki przy zachowaniu kontekstu przestrzennego i architektury tkanki.
Immunohistochemia (IHC) Staining: Short Definition
Types of Staining
Immunostaining może być wykonywany bezpośrednio lub pośrednio. Koniugacja naszych zwalidowanych pod kątem zastosowań przeciwciał z wieloma fluoroforami umożliwia bezpośrednie znakowanie. Aby przejrzeć naszą ofertę bezpośrednich koniugatów, kliknij tutaj.
Często, w oparciu o poziomy ekspresji antygenów i dostępność, bezpośredni koniugat nie jest wystarczający do wizualizacji interesującego nas celu. W takich przypadkach stosuje się pośrednie znakowanie przy użyciu przeciwciała drugorzędowego. Preferowaną metodą w CST jest wykorzystanie wysoce czułych, jednoetapowych, opartych na polimerach odczynników detekcyjnych specyficznych dla króliczych lub mysich IgG.
Przykłady barwienia IHC
Poniżej przedstawiono kilka przykładów barwienia IHC wykonanego w CST. Każde z przeciwciał używanych poniżej zostało poddane naszemu rygorystycznemu procesowi walidacji, aby z pewnością ocenić specyficzne wykrywanie pożądanego antygenu.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Analiza IHC ludzkiego raka płuca z warstwą parafiny przy użyciu PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Analiza IHC zatopionego w parafinie ludzkiego raka płuc z zastosowaniem PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: Analiza IHC ludzkiego raka piersi z warstwą parafinową przy użyciu CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: IHC analysis of paraffin-embedded human breast carcinoma using CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Analiza IHC zatopionego w parafinie ludzkiego raka endometrioidalnego przy użyciu α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb wykonana na Leica® Bond™ Rx.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Analiza IHC zatopionego w parafinie ludzkiego raka endometrioidalnego przy użyciu α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb wykonana na aparacie Leica® Bond™ Rx.
Jak wykonywane jest barwienie immunohistochemiczne (IHC)?
Przygotowanie tkanki
Procedury pobierania, konserwacji i utrwalania tkanki różnią się w zależności od próbki lub celu zainteresowania. Pobieranie i utrwalanie tkanki ma bezpośredni wpływ na integralność próbki i wyniki eksperymentu.
Utrwalacze sieciujące, takie jak formalina, są często używane do przygotowania próbek do IHC, ponieważ zachowują integralność strukturalną tkanki, co pomaga zachować jej architekturę. Inną opcją jest kriokonserwacja (zamrożenie) próbek, co może być lepszym rozwiązaniem, jeśli próbujesz wykryć fosforylowany cel.
Odzyskiwanie antygenu (epitopu)
Utrwalacze używane do zachowania integralności strukturalnej próbki tkanki mają również wady, ponieważ mogą zakopać epitop, do rozpoznania którego zostało zaprojektowane przeciwciało.
Istnieje kilka metod ujawniania epitopów, które zostały zamaskowane przez utrwalenie. Obejmują one odzyskiwanie antygenów indukowane proteolitycznie, które opiera się na enzymie takim jak proteinaza K, lub odzyskiwanie epitopów indukowane termicznie (HIER), które wykorzystuje ciepło do rozbijania wiązań krzyżowych i rozwijania białek. Każda z tych metod może zdemaskować epitopy, czyniąc je dostępnymi dla głównego przeciwciała i możliwymi do zabarwienia przez IHC.
W CST, naszą najczęstszą metodą odzyskiwania antygenów jest HIER. Jednakże, nasi naukowcy testują wiele metod odzyskiwania antygenu, aby określić optymalne warunki do użycia każdego przeciwciała w IHC. Zalecany protokół firmy CST można znaleźć w arkuszu danych każdego zwalidowanego przeciwciała IHC.
Wiązanie przeciwciała
Wybór właściwego przeciwciała jest jednym z najbardziej krytycznych kroków w uzyskaniu pomyślnego wyniku IHC. Wszystkie zwalidowane przeciwciała IHC z CST są weryfikowane nie tylko jako posiadające silny sygnał w tkance, ale przechodzą rygorystyczną procedurę walidacji w celu potwierdzenia specyficzności sygnału. Nasi naukowcy, specjalizujący się w IHC, testują dużą liczbę przeciwciał i polecają tylko te, które najlepiej nadają się do danego zastosowania.
Kliknij tutaj, aby przejrzeć przeciwciała zwalidowane pod kątem IHC dla Twojego celu.
Systemy detekcji
Barwienie immunohistochemiczne (IHC) pozwala na 2 szerokie klasy detekcji: 1) chromogenną i 2) fluorescencyjną. Do detekcji chromogennej CST zaleca stosowanie systemów opartych na polimerach, które pozwalają uniknąć ograniczeń systemu opartego na biotynie, jednocześnie zwiększając czułość badania.
Próbować SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, królik) #8114 lub SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, mysz) #8125 w zależności od gatunku gospodarza przeciwciała pierwotnego.
Detekcja oparta na polimerach jest bardziej czuła niż systemy oparte na biotynie. Analiza IHC zatopionego w parafinie ludzkiego raka płuc z użyciem Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 i detekcji opartej na biotynie (po lewej) lub detekcji opartej na polimerze (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; po prawej). Jak wykazano, detekcja oparta na polimerach oferuje zwiększoną czułość i powoduje bardziej trwałe barwienie.
Detekcja oparta na polimerach jest bardziej czuła niż systemy oparte na biotynie. Analiza IHC zatopionego w parafinie ludzkiego raka płuc z użyciem Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 i detekcji opartej na biotynie (po lewej) lub detekcji opartej na polimerze (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; po prawej). Jak pokazano, detekcja oparta na polimerach oferuje zwiększoną czułość i skutkuje bardziej wytrzymałym barwieniem.
Nie wszystkie substraty DAB działają tak samo. Analiza IHC ludzkiego raka piersi z zatopionymi parafinami z użyciem Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. Wykrywanie chromogeniczne przeprowadzono przy użyciu zestawu SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (po lewej), DAB dostarczanego przez konkurenta 1 (w środku) lub DAB dostarczanego przez konkurenta 2 (po prawej). Chociaż DAB konkurenta 2 wytwarza sygnał porównywalny z SignalStain® DAB Substrate Kit, DAB konkurenta 1 daje znacznie słabszy sygnał.
Nie wszystkie substraty DAB działają tak samo. Analiza IHC ludzkiego raka piersi z zatopioną parafiną z użyciem Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. Wykrywanie chromogeniczne przeprowadzono przy użyciu zestawu SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (po lewej), DAB dostarczanego przez konkurenta 1 (w środku) lub DAB dostarczanego przez konkurenta 2 (po prawej). Chociaż DAB konkurenta 2 wytwarza sygnał porównywalny z SignalStain® DAB Substrate Kit, DAB konkurenta 1 daje znacznie słabszy sygnał.
Barwienie przeciwciał
Po wykryciu przeciwciał wielu badaczy preferuje barwienie przeciwciałami tkanki w celu uwidocznienia anatomii komórkowej i zorientowania widza w odniesieniu do określonego barwienia. W CST, kontarstujemy nasze próbki używając Hematoksyliny #14166, która barwi jądra na niebiesko. Przy wyborze kontrbarwnika ważne jest, aby kontrbarwnik był kompatybilny z chromogenem. Na przykład, jeśli kolor kontrbarwnika jest zbyt podobny do koloru chromogenu, sygnał przeciwciała będzie trudny do rozpoznania.
Protokół barwienia immunohistochemicznego (IHC)
Poniżej znajduje się przegląd naszego zalecanego protokołu i podkreślone są kluczowe kroki do udanego eksperymentu. Celem CST jest pomoc w udoskonaleniu analizy IHC poprzez dostarczenie zwalidowanych przeciwciał i odczynników, aby umożliwić stosowanie prostego, specyficznego dla produktu protokołu i uzyskanie powtarzalnych wyników przy minimalnej wymaganej optymalizacji.
Zobacz film o protokole IHC lub odwiedź naszą stronę wyboru protokołu.