DISCUSSION
Citrobacter jest znaczącą przyczyną zakażeń oportunistycznych; C. diversus jest związany z około 40% prezentowanych przypadków, podczas gdy C. freundiireprezentuje około 29% (11). Citrobacterspp. powodują zapalenie opon mózgowych u noworodków i mają niezwykłą skłonność do wywoływania ropni mózgu (8, 14). Patogeneza Citrobacter spp. powodujących zapalenie opon mózgowych i ropień mózgu nie jest dobrze scharakteryzowana; jednakże, podobnie jak w przypadku innych bakterii powodujących zapalenie opon mózgowych, musi dojść do penetracji bariery krew-mózg. Obecne badania zostały podjęte w celu lepszego zrozumienia potencjalnych interakcji Citrobacter z barierą krew-mózg. C. freundii została wybrana jako bakteria modelowa do tych badań, ponieważ genetyka bakterii jest lepiej zdefiniowana, a biblioteka genomowa jest dostępna dla ewentualnych badań dotyczących molekularnych podstaw inwazjiCitrobacter i replikacji w HBMEC. Eksperymenty przeprowadzone z izolatem płynu mózgowo-rdzeniowego C. diversus dały podobne wyniki (dane nie pokazane), sugerując, że częstotliwość i mechanizm inwazji HBMEC dla tych dwóch gatunków mogą być podobne.
Bariera krew-mózg jest złożoną strukturą, która składa się z nabłonka splotu naczyniowego i śródbłonka kapilar mózgowych. Obecność ścisłych połączeń i niska aktywność pinocytotyczna komórek śródbłonka powoduje ograniczenie przechodzenia makroelementów przez barierę krew-mózg. W chwili obecnej nie wiadomo, gdzie w barierze krew-mózg przenika C. freundii, ale stwierdzono, że splot naczyniówkowy jest rzadko zaangażowany w szczurzym modelu eksperymentalnego hematogennego Citrobacter meningitis (16). Ponadto, komórki śródbłonka mikronaczyniowego pokrywają największą powierzchnię bariery krew-mózg, a wykazano, że inne bakterie wywołujące zapalenie opon mózgowych wnikają do komórek śródbłonka mikronaczyniowego in vitro (13, 20, 25). Dlatego do naszych badań wybraliśmy HBMEC. Testy inwazji w hodowlach tkankowych i badania TEM dostarczyły dowodów, że C. freundii inwazyjnie atakuje HBMEC. Wyniki badań inwazyjnych przeprowadzonych w obecności różnych inhibitorów komórek eukariotycznych sugerują, że inwazja C. freundii do HBMEC jest procesem zależnym od mikrofilamentów, mikrotubul, syntezy białek de novo i zakwaszania endosomów. Testy przedłużonej inwazji wykazały, że C. freundii może przetrwać i replikować się wewnątrzkomórkowo przez dłuższy czas w warunkach in vitro. Analizy TEM wykazały, że wewnątrzkomórkowe umiejscowienie pojedynczych i wielu komórek C. freundii znajduje się w pojedynczych strukturach błoniastych przypominających wakuole. Eksperymenty transwell wykazały, że C. freundii może przemieszczać się przez spolaryzowaną monowarstwę HBMEC, podczas gdy nieinwazyjne E. coli nie. Ponadto, nasze wstępne dane pokazują, że C. freundii przenika przez barierę krew-mózg w modelu doświadczalnego hematogennego zapalenia opon mózgowych u szczurów noworodków (21). Łącznie, wyniki te sugerują, że C. freundii wnika do wakuoli, prawdopodobnie replikuje się, transcytuje przez HBMEC, jest uwalniany do strony podstawnej i w ten sposób przenika przez barierę krew-mózg.
Inwazja komórek eukariotycznych przez C. freundii została zgłoszona (22, 35). Jest to jednak pierwsze doniesienie na temat inwazji HBMEC przez C. freundii. Co ciekawe, wymagania eukariotyczne dla inwazji C. freundii są tak zróżnicowane, jak typy komórek, które C. freundii może inwazyjnie atakować. Na przykład, wykazano, że MDC, inhibitor wgłębień pokrytych klatryną, hamuje inwazję C. freundii we wszystkich innych badanych typach komórek (np. ludzkich komórkach nabłonka naczyniowego, jelitowego i pęcherza moczowego) z wyjątkiem, jak wykazano w tym badaniu, HBMEC. Ponadto, inne scharakteryzowane dotychczas bakterie wywołujące zapalenie opon mózgowych wnikają do HBMEC drogą(ami) zależną od mikrotubul i wrażliwą na MDC (20, 24, 27). Nie wykazano, aby inhibitory MDC i ouabaina hamowały wszystkie receptory; dlatego może być tak, że receptor niezbędny do inwazji C. freundii do HBMEC nie jest naruszony przez inhibitor MDC lub ouabainę. Chociaż zebrane do tej pory dowody sugerują, że wnikanie C. freundii do HBMEC może nie zachodzić na drodze wrażliwej na receptory MDC lub ouabainę, wydaje się, że wymagane jest zakwaszenie endosomów i synteza białek de novo. Dostępne dane sugerują dwa możliwe scenariusze. Zakwaszenie endosomów może być potrzebne jako bodziec środowiskowy dla wewnątrzkomórkowego przeżycia bakterii. Podobne wymagania zostały scharakteryzowane dla inwazji nabłonka Salmonella (26). Alternatywnie, zakwaszenie endosomów i synteza białek mogą być wymagane do oddzielenia kompleksu ligand-receptor, syntezy receptora i/lub prezentacji receptora na powierzchni HBMEC, aby mogła nastąpić inwazja C. freundii. Ten ostatni scenariusz przypomina inne inwazyjne patogeny, gdzie kontakt z żywym organizmem jest konieczny do modulacji cząsteczek adhezji komórek eukariotycznych, które są niezbędne do inwazji (np. Streptococcus pneumoniae i receptor czynnika aktywującego płytki krwi) (2). W naszym laboratorium trwają eksperymenty mające na celu rozróżnienie tych proponowanych scenariuszy.
Atesty inwazyjne wykonywane w obecności inhibitorów mikrotubul (zarówno środków depolimeryzujących jak i stabilizujących) znacząco zmniejszały zdolność HBMEC do pobierania C. freundii. Eksperymenty w mikroskopii konfokalnej z użyciem przeciwciał anty-α-tubulinowych wykazały, że mikrotubule agregują się po kontakcie HBMEC z C. freundii. Agregacja mikrotubul była procesem zależnym od czasu; nie zaobserwowano agregacji w 5 minucie, niewiele w 15 minucie, a wyraźną agregację zaobserwowano po 30 minutach inkubacji C. freundii z HBMEC. Agregacja mikrotubul była hamowana, gdy komórki poddawano działaniu inhibitorów mikrotubul lub środków hamujących powstawanie mikrofilamentów. Co ciekawe, wzór barwienia agregacji mikrotubul nie kolokował się z wiązaniem bakterii, a obszary HBMEC, które nie wykazywały wiązania C. freundii również wykazywały wyraźne zbrylanie się mikrotubul. Sugeruje to, że kontakt bakterii z HBMEC może globalnie stymulować agregację mikrotubul. Nie wiadomo, czy agregacja mikrotubul jest wynikiem działania wydzielanego czynnika bakteryjnego, czy też parakrynnej odpowiedzi na wiązanie się bakterii z HBMEC. Ponadto, agregacja mikrotubul w odpowiedzi na wiązanie C. freundii może być związana z postulowaną prezentacją receptora poprzez syntezę białek de novo i zakwaszenie endosomów. Wcześniej wykazano, że transport wielu receptorów do i z powierzchni komórki jest zależny od mikrotubul (10). Dlatego jednym z wyjaśnień hamującego wpływu inhibitorów mikrotubul na wnikanie C. freundii do HBMEC jest to, że środki te mogą zmniejszać liczbę receptorów HBMEC, które pośredniczą w inwazji C. freundii. Eksperymenty są w toku, aby rozróżnić te możliwości.
Mikrotubule były wcześniej wykazane jako wymagane do inwazji wielu patogenów (np. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropatogenne i enterokrwotoczne E. coli oraz Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Ogólnie uważa się, że chociaż patogeny te mogą wnikać przez szlaki zależne od mikrotubul, to zwykle nie replikują się wewnątrzkomórkowo (6). Dane uzyskane w tym badaniu z rozszerzonych testów inwazyjnych i analizy TEM sugerują, że C. freundii może być wyjątkiem od tego uogólnienia. W przeciwieństwie do tego, co opisano w przypadku innej bakterii replikującej się wewnątrzwakuolowo, Legionella pneumophila(12), nie zaobserwowano obecności mitochondriów ani rybosomów w pobliżu bakterii. Sugeruje to, że C. freundii może nie wykorzystywać tych organelli do bezpośredniego pozyskiwania energii lub że rekrutacja specyficznych białek komórki gospodarza może nie być wymagana do wewnątrzkomórkowego przetrwania i proliferacji (jak w przypadku L. pneumophila). Mając szczególne znaczenie dla infekcji ośrodkowego układu nerwowego, wykazano, że inne bakterie wywołujące zapalenie opon mózgowych, takie jak E. coli K1, GBS i S. pneumoniae, w podobny sposób dokonują inwazji (1, 13, 25) lub dokonują inwazji i transcytozy (20, 27) BMEC; jednakże nie stwierdzono, aby organizmy te replikowały się w HBMEC. Jak opisano powyżej, Citrobacter meningitis zostało udokumentowane ze względu na wysoką częstość tworzenia ropni mózgu. To, czy replikacja w wakuolach HBMEC jest unikalna dla Citrobacter i czy istnieje korelacja z tworzeniem ropni, pozostaje do ustalenia.
Cytochalazyna D hamuje inwazję C. freundii do HBMEC; jednakże, używając barwienia immunologicznego, nie znaleźliśmy wykrywalnej reorganizacji mikrofilamentów, gdy C. freundii oddziaływał z HBMEC (dane nie pokazane). Ponadto, wstępne traktowanie HBMEC cytochalsyną D hamowało zależną od bakterii agregację mikrotubul wizualizowaną za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wyniki te można tłumaczyć na kilka sposobów. Efekt cytochalsyny D na zależną od bakterii agregację mikrotubul może być spowodowany pośrednim wpływem inhibitora mikrofilamentów na sieć mikrotubul. Na przykład, zaobserwowano, że mikrotubule działają jako struktury kotwiczące dla F-aktyny (28). Dlatego też zaburzenie sieci mikrofilamentów może wpływać na sieć mikrotubul i w ten sposób pośrednio wpływać na zależną od mikrotubul inwazję C. freundii w HBMEC. Alternatywnie, etap inwazji zależny od aktyny może poprzedzać etap zależny od mikrotubul w inwazji C. freundii do HBMEC. Ten początkowy etap może skutkować reorganizacją mikrofilamentów, gdy bakterie początkowo stykają się z HBMEC; jednakże te zdarzenia mogą być przemijające, a projekt eksperymentalny wykorzystujący mikroskopię immunofluorescencyjną może nie wykryć odpowiednio ich występowania. Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku inwazji wywołanej przez Yersiniainvasin (36). Jeśli więc początkowe etapy inwazji są uniemożliwiane przez cytochalazynę D, to kolejne etapy inwazji, które są zależne od mikrotubul, nie są uruchamiane. Wcześniej wykazano, że aktyna funkcjonuje w translokacji białkowych czynników wiążących aktyny do błony plazmatycznej, jak również w sygnalizacji cytozolowej (19). Ponadto cytochalazyna D hamuje wnikanie Salmonella poprzez zaburzenie translokacji białek wiążących aktynę do miejsca wnikania bakterii (7). Jest możliwe, że w przypadku inwazji C. freundii na HBMEC, mikrofilamenty aktyny są niezbędne do sygnalizacji cytozolowej i/lub penetracji bakterii przy błonie plazmatycznej, a mikrotubule mogą być niezbędne do transportu bakterii związanych z błoną z błony plazmatycznej w kierunku strony podstawnej (lub głębiej do wnętrza komórki). Tak więc, zakłócenie na którymkolwiek z etapów inwazji spowodowałoby „korek uliczny”.
Podsumowując, przedstawione tutaj wyniki wskazują, że C. freundii może dokonywać inwazji, namnażać się wewnątrz i transcytować HBMEC in vitro. Określenie genetycznych podstaw tych fenotypów zapewni znaczący wgląd w patofizjologię Citrobactermeningitis i potencjalnie pomoże w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych i zapobiegawczych. Ponadto, obszerna molekularna analiza porównawcza Citrobacter z innymi bakteriami wywołującymi zapalenie opon mózgowych może rzucić światło na unikalną właściwość Citrobacter do tworzenia ropni mózgu.
.