Metabolic engineering of Escherichia coli for production of cinnamaldehyde

シンナミックアルデヒドの生合成と合成酵素のin vitro測定。 a l-フェニルアラニンからシンナムアルデヒドを生合成するための3つの酵素反応（PAL，4CL，CCL）。 b A. thaliana (AtPAL1, black) および S. maritimus (SmPAL, white) からのPALの30および37℃におけるインビトロアッセイ。 (i) A. thaliana 由来の 4CL (At4CL1) と A. thaliana 由来の CCR (AtCCR), および (ii) S. coelicolor 由来の CCL (ScCCL) と A. thaliana 由来の CCR (AtCCR) を含む 2 つの組み合わせに桂皮酸を混ぜ、シンナミックアルデヒド生成を分析した。 エラーバーは平均値の標準偏差を表す（n = 2）

また、Streptomyces coelicolor（ScCCL）およびA. thaliana（At4CL）の2種類の4CL酵素について、大腸菌で桂皮酸をシンナミックアルデヒドに変換する適性について検討しました。 At4CLは、14種類のアイソフォーム（At4CL1-At4CL14）が存在することが知られています。 このうち、At4CL1-3 は桂皮酸に対して同様の活性を示すが、残りのアイソフォームは桂皮酸に対して活性を示さない。 そこで、At4CL1 を代表として選択した。 また、cinnamoyl-CoA から cinnamaldehyde への変換には A. thaliana 由来の CCR enzyme (AtCCR1) を使用した。 各 4CL 酵素（At4CL1 と ScCCL）は、A. thaliana 由来の CCR 酵素（AtCCR）と組み合わせてテストした。 すべての酵素は高純度で精製することに成功した（Additional file 1: Figure S1）。 At4CL1 と ScCCL の酵素活性を比較するため、(i) At4CL1 と AtCCR、および (ii) ScCCL と AtCCR の 2 つの反応を準備し、基質として桂皮酸を混合した。 30℃と37℃でインキュベートした後、HPLCでシンナムアルデヒドの力価を分析した。 図1cに示すように、ScCCLとAtCCRの組み合わせは、At4CL1とAtCCRの組み合わせよりも高いシンナムアルデヒドの生産力価（30℃反応時4.4倍、37℃反応時10.4倍）を示すことが明らかとなった。 これらの結果を踏まえ、以下の酵素を用いて大腸菌でシンナムアルデヒド生合成系を以下のように 構築した。 SmPAL、ScCCL、AtCCR＜8406＞＜3098＞大腸菌におけるシンナムアルデヒド生合成経路の構築＜2863＞＜1754＞大腸菌でシンナムアルデヒドを生産するために、SmPAL、ScCCL、AtCCR遺伝子を以下の順序でpTrc99Aにクローニングした。 SmPAL、ScCCL、AtCCR（pHB-CADを生じる）の順でpTrc99Aにクローニングした（図2a）。 pHB-CAD を保有する大腸菌 W3110 を 2 種類の温度（30℃と 37℃）で培養し、シンナムアルデヒド生産に最適な温度を探した。 酵素の発現は、「方法」に記載したように、SDS-PAGE、続いてウェスタンブロット分析によって解析した。 いずれの温度でも、すべての酵素は良好に発現し、高い溶解性を示した（Fig. 2b）。 各酵素の発現量は異なるが、37 ℃では30 ℃よりもわずかに発現が良好であった。 また、培養液中に生成したシンナムアルデヒドの力価をHPLCで分析したところ、37℃では30℃に比べて4.5倍高いことがわかった（Fig. 2c）。 37℃におけるシンナムアルデヒドの高い生産力価は、30℃でも活性のある生合成酵素が、37℃では全ての生合成酵素の発現量が活発に増加したためであると推測された。 以下、シンナムアルデヒド生産のための培養はすべて37℃で行った。

発現系の構築、各酵素およびシンナムアルデヒドの生産E. a IPTG誘導型trcプロモーター（Ptrc）下で3つの合成遺伝子（SmPAL、ScCCL、AtCCR遺伝子）を発現させるプラスミドpHB-CADの模式図である。 RBS は翻訳のためのリボソーム結合部位を意味し、制限酵素部位は指定した。 b 2 種類の温度（30℃と 37℃）下での遺伝子発現をウェスタンブロットで解析した。 SmPAL の検出（レーン 1-4）には抗 FLAG-HRP 抗体を、ScCCL と AtCCR の検出（レーン 5-8）には抗 His-HRP 抗体を使用した。 レーン1、3、5、7は総タンパク質画分を、レーン2、4、6、8は可溶性タンパク質画分を示す。 レーン1、2、5、6は30℃、レーン3、4、7、8は37℃の試料を示す。 記号で示す。 c 2 つの異なる温度で生成したシンナムアルデヒドの HPLC 分析。 エラーバーは平均の標準偏差を表す（n = 3）

L-フェニルアラニンの細胞内プールを増やすための菌株工学

シンナムアルデヒドの生合成には、必須前駆体としてL-フェニルアラニンが必要である． そのため、シンナムアルデヒドの生成を促進するためには、l-フェニルアラニンの細胞内プールを増加させることが望まれる。 この目的のために、我々はl-フェニルアラニンをより多く生産するように大腸菌を合理的に設計し直した。 入手可能な代謝・調節情報を参考に、大腸菌W3110を以下のように操作した。 (i) 基質取り込み速度の調節、代謝産物のオーバーフローの減少、前駆体の濃縮のためにグルコース特異的ホスホエノールピルビン酸リン酸転移酵素系（PTS）に関連するEIIAGlcタンパク質をコードするcrr遺伝子の欠失、 (ii) 芳香族アミノ酸（AAA）合成遺伝子から成るTyrR制御系の厳しい制御を緩和するためにtyrR遺伝子を欠損させる、 (iii) グルコース依存的なPTSをコードするTyrR遺伝子の欠失。 (iii) trpE（アントラニル酸合成酵素コンポーネント）とtyrA遺伝子の欠失により、競合経路（l-トリプトファンとl-チロシンの生合成）への炭素流失を防ぐ。 (iv) pykA（pyruvate kinase A）遺伝子の欠失により、前駆体を濃縮し成長とl-フェニルアラニン生産間のフラックスを均衡させた（図参照）。 3). 以上のスキームに基づき、大腸菌W3110の5つの順次ノックアウト変異体（YHP01〜YHP05）を開発した（表1）

E. coli W3110のL-フェニルアラニンのプールを増加する株工学に関する図式的な図である。 記号 “X “は対応する遺伝子欠失を示す。 赤色矢印は、関連する遺伝子（galP、glk、aroG、ydiB、aroK.）の過剰発現を示す。 pheA）をプラスミド（pYHP）ベースの発現系で発現させた

まず、グルコース特異的ホスホエノールピルビン酸PTSはCrr遺伝子欠損により不活性化したE. coli W3110株のcrr遺伝子を欠失させ、E. coli YHP01を得た。 しかし、マンノース特異的PTSとガラクトースパーミアーゼが引き続きグルコースを細胞質内に取り込むため、YHP01はグルコースを唯一の炭素源として含む培地で増殖することができる。 PTSをバイパスすることにより、ホスホエノールピルビン酸（PEP）のプールが増加し、最終的にl-フェニルアラニンの合成が促進される。 次に、YHP01のtyrR遺伝子を欠失させ、YHP02株を得た。 TyrRタンパク質は、AAA生合成に関わる8つの遺伝子を含むTyrR regulonの制御因子である 。 また、TyrRタンパク質を欠失させると、AAA合成に関連する遺伝子の制御が緩和され、l-フェニルアラニンプールを増加させることができる。 次に、YHP02株から順にtrpEとtyrA遺伝子を欠失させ、それぞれYHP03とYHP04株を得た。 AAAsの生合成経路では、最終的にコリスミン酸がPheA、TrpE、TyrA酵素によってそれぞれl-フェニルアラニン、l-トリプトファン、l-チロシンに変換される分岐点が発生する。 trpEとtyrA遺伝子の欠失は、l-トリプトファンとl-チロシンの生合成の競合経路への炭素の損失を防ぐことができる。 最後に、YHP04のpykA遺伝子を欠失させ、YHP05株を得た。 pykA遺伝子は、PEPを消費する第二段階を構成するピルビン酸キナーゼA（PykA）をコードしている。 PykA遺伝子を欠損させることにより、より多くのPEPをシキミ酸経路で使用することができ、その結果、より多くのl-フェニルアラニンを生産することができる。 YHP01-YHP05は、PCRとアガロースゲル電気泳動により遺伝子欠失を確認した(Additional file 3: Figure S3)。 48時間培養した結果、いずれの人工株もW3110株よりわずかに増殖が良く、特にE. coli YHP05株が最も高い細胞密度を示した（Fig.4a）。 また、PTS と Pyk アイソザイムを不活性化すると、グルコースの取り込みと異化が減少し、中間代謝物 の量が保存されるため、バイオマス生成への炭素フラックスが増加することが、以前の研究で確認されてい る。 また、培養上清中の l-フェニルアラニンの生産力価を HPLC で分析した。 親株のW3110では、l-フェニルアラニンの生産力価は0.24 g/Lであったが、大腸菌の遺伝子組み換え株では、l-フェニルアラニンの生産力価は徐々に上昇していた（Fig. 4a）。 crr, tyrR, trpE, tyrA, pykA遺伝子を欠失させた大腸菌YHP05は、最も高いl-フェニルアラニン生産力価（0.52 g/L）を示し、親株の大腸菌W3110と比較して2.2倍であった。 図4

48時間フラスコ培養における最終光学濃度（黒）とl-フェニルアラニン生産量（灰）の比較 a 5つの工学的E. b 大腸菌YHP05株に異なるプラスミド（pTac15kGシリーズまたはpYHP）を導入して培養し、細胞増殖（OD600）およびl-フェニルアラニン生産量を比較したものである。 エラーバーは平均値の標準偏差を表す（n = 3）

プラスミドによる過剰発現システムでl-フェニルアラニンの細胞内プールを増加

大腸菌YHP05株を始め、プラスミドによる遺伝子過剰発現でl-フェニルアラニンの生産がさらに改善された。 シキミテートとl-フェニルアラニンによるl-フェニルアラニン合成経路におけるフィードバック阻害は、以下のようにシキミテート経路に関与する酵素のアイソザイムの過剰発現や変異の導入により軽減された。 (i) aroGにコードされる3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase遺伝子を工学的に過剰発現させる（AroG8/15） (ii) shikimate dehydrogenaseおよびshikimate kinaseをコードするydiBおよびaroK遺伝子はshikimate経路への炭素流入を促進するために過剰発現させる (I),acroKはshikimate pathwayに関与する酵素をコードするために過剰発現させる (III) 。 (iii) 基質結合親和性向上のためのエンジニアリングを施したCHA変異体／プレフェン酸脱水酵素をコードするpheA遺伝子の過剰発現（PheAfbr、dm）、(iv) グルコース取り込みを促進するgalP (galactose permease) およびglk (glucokinase) 遺伝子の過剰発現 (Additional file 4: 図S4）。

まず、フィードバック阻害を緩和するために、人工的にaroG8/15遺伝子を組み込んだプラスミドpTac15kGを構築した。 AroGはDAHPの合成に関与する主要な酵素であるが、AroGはl-フェニルアラニンによって完全に阻害される（0.1 mMと低い） 。 2 つの変異（D146N と A202T） を導入すると、高い特異的活性を保ったままフィードバック阻害に耐えることが知られている （AroG8/15）ので、この変異体 AroG8/15 酵素を過剰発現させることにした。 次に、2 種類のプラスミド（pTac15kGB と pTac15kGBK）を構築し、それぞれ ydiB と aroK 遺伝子を aroG8/15 遺伝子とともに過剰発現させた。 シキミメート経路への代謝フラックスは、シキミメート脱水素酵素 (YdiB) とシキミメートキナーゼ (AroK) を過剰発現させることで向上させることができる。 また、コリスメートムターゼ/プレフェン酸デヒドラターゼをコードするpheA遺伝子を変異させたpTac15kGBKAプラスミドを構築し、過剰発現させることに成功した。 このコンストラクトでは、制御ドメインを除いた野生型 PheA（PheAfbr）の最初の 300 アミノ酸のみを増幅したため、PheAfbr はフィードバック阻害の影響を弱く受けている。 また、PheAfbrは基質との結合親和性が低いため、野生型PheAよりもKm値が高い。そこで、PheAfbrに2つの変異（E159AおよびE232A）を導入し、基質との結合親和性を向上させてPheAfbr、dm を得た。 最後に、pYHPプラスミドを構築し、ガラクトースパーミアーゼとグルコキナーゼをそれぞれコードするgalPとglk遺伝子を追加で過剰発現させた。 両酵素はグルコースの取り込みを促進する。

pTac15kG、pTac15kGB、pTac15kGBK、pTac15kGBKA、pYHPの5種類のプラスミド（表1）を構築した後、各プラスミドを大腸菌YHP05に形質転換させた。 半定形培地を入れた振盪フラスコで48時間培養した後、細胞増殖とl-フェニルアラニンの生産力価を分析した。 全ての細胞が良好に増殖し、特にpYHPを保有する大腸菌YHP05は、他の細胞よりもわずかに高い細胞密度（OD600 = 9.76）まで増殖した（図4b）。 また、培養上清中のl-フェニルアラニンの生産力価をHPLCで分析したところ、l-フェニルアラニンの生産力価は、培養上清中のl-フェニルアラニンの生産力価を上回った。 aroG8/15遺伝子（pTac15kG）を過剰発現させると、プラスミドを保有していないYHP05（0.52g/L）と比較して、l-フェニルアラニン生産量が大幅に増加した（2.25g/L）（Fig. 4b）。 その後、他の遺伝子を過剰発現させたところ、l-フェニルアラニンの生産価は順次上昇し、pYHPを保有する大腸菌YHP05が最も高いl-フェニルアラニン生産価（3.91g/L）を示した（Fig. 4b）。 pYHPプラスミドの効果により、l-フェニルアラニン生産量はそれぞれ16.4倍、7.5倍と顕著に増加した。 pYHPを保有する大腸菌YHP05の培養では、グルコースに対するl-フェニルアラニン収量は0.270 g/g、生産性は0.082 g/L/hだった（追加ファイル5：図 S5）。 このように、pYHPを保有する人工大腸菌YHP05では、l-フェニルアラニンのプールが著しく改善された。 Liu らは、以前、大腸菌での l-フェニルアラニンの生産量が 47 g/L という高い値を示したことを報告している . しかし、この記録は供給バッチ培養（15 Lスケール）で達成されたもので、彼らはl-フェニルアラニントランスポーター（YddG）の共発現を利用して、培養液中にl-フェニルアラニンを効率的に生産している。 本研究では、l-フェニルアラニンの生産ではなく、シンナムアルデヒドの生産を最終目的としているため、YddGの導入は行っていない。 私たちの研究で得られたl-フェニルアラニンの力価は最高記録ではありませんでしたが、シンナムアルデヒドを生産するためには十分な力価であると考えられました。 8406>

Cinnamaldehyde production in the engineered E. coli

pYHPを保有する大腸菌YHP05を使用して、まず桂皮酸の生産について検討しました。 この実験のために、IPTG誘導可能なtrcプロモーター下にSmPAL遺伝子を含むプラスミドpHB-CAを構築した(表1)。 pHB-CAとpYHPの両方を保有する大腸菌YHP05をフラスコで48時間培養し、桂皮酸の生産力価を解析したところ、桂皮酸の生産力価は1.5倍であった。 また、対照としてpHB-CAを保有する大腸菌YHP05と大腸菌W3110（pYHPなし）を調べた。 すべての細胞の成長パターンは類似しており（Fig. 5a）、pHB-CAを保有する大腸菌W3110とYHP05は、それぞれ79と108 mg/Lの桂皮酸を生成した（Fig. 5b）。 pHB-CAとpYHPの両方を保有する大腸菌YHP05は、pHB-CAを保有する大腸菌W3110およびYHP05と比較して、生産力（287 mg/L）が3.6倍および2.7倍に向上した（Fig. 5b）。 また、この生産量は、大腸菌で報告されている最高値（186 mg/L）よりも1.5倍高い値であることが確認された。 図5

フラスコ培養における細胞増殖とシンナムアルデヒド生産。 a 細胞増殖のタイムプロファイル（OD600）。 記号は 閉じた円、大腸菌W3110（pHB-CAD）、開いた円、大腸菌YHP05（pHB-CAD）、閉じた四角、大腸菌YHP05（pHB-CADとpYHP）。 b 各株のシンナムアルデヒドの生産力価。 エラーバーは平均値の標準偏差（n = 3）

cinnamaldehyde 処理後の線虫生存率（％）のグラフ。 記号は 閉じた菱形、陰性対照として大腸菌W3110の培養上清、閉じた円、陽性対照として60mg/Lの市販・精製シンナムアルデヒド、開いた円、pYHPとpHB-CADを保有する大腸菌YHP05で生産したシンナムアルデヒドで60mg/L培養上清を示す。 エラーバーは平均値（n = 2）の標準偏差を表す

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