Effects of magnesium citrate, magnesium oxide and magnesium sulfate supplementation on arterial stiffness in healthy overweight individuals.A Trials – The Study Protocol for the randomized controlled trial: 無作為化比較試験のプロトコール

試験デザイン

この無作為化二重盲検プラセボ比較試験では、健康な過体重およびやや肥満のボランティアが3つのマグネシウム群またはプラセボ対照群のいずれかに割り付けられます。 本試験はUniversity Medical Center Groningen（UMCG）で実施される予定です。 今回のプロトコルは、Standard Protocol Itemsに準拠して作成された。 今回のプロトコルは、SPIRIT（Standard Protocol Items: Recommendations for Interventional Trials）ガイドラインに準拠して作成した（図1、Additional file 1）。 図1

参加者の特徴

本試験では、書面での同意が得られる被験者のみが対象である。 さらに、参加者は45～75歳で、過体重または軽度肥満（肥満度25～35kg/m2）でなければならない。これは、これらの被験者はベースラインで動脈硬化と血圧が上昇しており、介入による改善が可能であると予想されるためである。 ホルモンの影響による試験結果の変動を避けるため、閉経後の女性（最終月経から2年以上経過）のみを対象とする。 以下の基準のいずれかに該当する参加者は、本試験の対象とはなりません：

• 高マグネシウム摂取（尿中マグネシウム排泄量が7.0以上または5以上と定義される）。9 mmol/24h（男性、女性それぞれ）;

• 血漿グルコース≥7.0 mmol/l;

• 血清総コレステロール≥ 8.0 mmol/l;

• 血清トリグリセライド≥ 2.1 mmol/l;

血清総コレステロール≥ 7.0 mmol/l;

• 血漿トリグリセイド≥ 2.0 mmol/l2 mmol/l;

• 現在喫煙者または禁煙<12ヶ月;

• 糖尿病の存在。

• 家族性高コレステロール血症；

• 薬物の乱用；

• アルコール摂取が週に21回以上。

• 不安定な体重（過去3ヶ月で体重が2248kg以上増加または減少）;

• プロトンポンプ阻害剤の使用;

• 過去6ヶ月で開始した脂質低下薬および/または降圧療法の使用。

• 過去1ヶ月以内にマグネシウムサプリメントまたは他の生物医学内の治験薬の使用；

• てんかん、ぜんそく、腎不全または腎不全、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、自己炎症疾患および関節リウマチなどの試験に干渉する可能性がある重度の医学的状態。

• 活動性の心血管疾患；または

• 試験開始8週間前および試験期間中に血液提供者（または血液提供したこと）を放棄する意思がないこと。

Interventions

体重過多およびやや肥満の参加者は、クエン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸マグネシウム、またはプラセボのいずれかを受けるようにランダムに割り付けられます。 研究介入のフローチャートを図2に示す。 試験参加者には、1日3回、2カプセルを24週間摂取してもらう。 試験当日は、すべての測定が終了した後に最初の2カプセルを服用する。 各マグネシウムサプリメントは75mgのマグネシウム（クエン酸マグネシウム複合体（Mg 15.5%） 硫酸マグネシウム複合体（17.4%）と酸化マグネシウム複合体（60.3%）；AMT Laboratories Inc.）を提供します。 従って、6粒で1日当たりのマグネシウム摂取量は450mgとなります。 プラセボカプセルはデンプン（Amylum solani）を含む。 24週間という治療期間は、24週間後に動脈硬化に対するマグネシウム補給の有意な効果を示した我々の以前の研究に基づいている。 ベースライン、2週目、12週目、24週目に、参加者はPWVc-f、診察室血圧、身体組成の測定を受けることになる。 各試験日の前に、参加者は24時間尿と糞便のサンプルを採取する。 さらに、被験者には各試験日の前に患者健康質問票（PHQ-15）を記入してもらう。 PHQ-15は、PHQ全体から派生した体性症状の下位尺度である。 この質問票には、外来で報告される身体的愁訴の90％以上を占める約15の身体症状または症状クラスターが含まれている。 最後に、被験者は、病気の兆候、使用した薬、研究期間中のプロトコールからの逸脱を日記に記録する。 被験者には、研究期間中、身体活動レベル、食事摂取パターン、アルコールの使用を変えないよう要請されている

盲検化と無作為化

二重盲検デザインを確実にするために、光学的に似たカプセルは、試験薬（マグネシウムサプリメントとプラセボ）を供給するラボMedisan（ヘーレンフェーン、オランダ）によって包装およびコード化が行われます。 さらに、この研究所は無作為化の手順も実施する。 このために、彼らは論理的順序でカテゴリー別のリストを作成する。 このリストには、各被験者に対して1つの介入が含まれる。 コンピュータで作成された乱数リストに基づき、被験者はいずれかの群に無作為に振り分けられる。 この結果、治療配分の無作為化リストが得られる。

サンプルサイズの計算

本研究は、主要評価項目である動脈硬化に検出力を付与している。 非劣性検定に必要なサンプルサイズは、マージン0.5m/s、確率0.05、検出力0.80に基づいて算出されています。 したがって、マグネシウム群あたり41名の被験者が必要である。 クエン酸マグネシウムとプラセボの比較では、2群間試験で算出した1群あたりの被験者数（n＝24）で十分であると考える。 10％の脱落率が予想されるため、162名を採用し試験を開始する。 スクリーニングに含まれる被験者のうち、すべての参加基準を満たし、参加する意思があるのは50％だけであることを考慮すると、324人の被験者がスクリーニング訪問に参加すると予想される。

このサンプルサイズの計算は、我々の以前の研究で見つかったマグネシウム補給24週後のPWVc-fの被験者内変動0.9 m/秒、変化1.0 m/秒に基づいている。 同等マージン0.5m/sは、観察された効果に基づいており、プラセボと比較してクエン酸マグネシウム補給の効果の50％である。 サンプルサイズの計算には、Juliousの公式を使用した。

介入へのコンプライアンス

コンプライアンスは、12週間後と24週間後のカプセルの返却数に基づいて評価される。 被験者は、カプセルの80%以上を服用した場合、コンプライアンスとみなされます。 さらに、試験終了時の尿中マグネシウム濃度によってコンプライアンスを評価する。

主要アウトカム

PWVc-fはSphygmoCor v9 (AtCor Medical, West Ryde, Australia) を使用して二重に記録される。 まず、胸骨上部の切り欠きから大腿骨記録部位（臍を経由）までの距離を測定する。 その後、胸骨上部のノッチから頸動脈の記録部位（右）までの距離を減算する。 さらに、頸動脈記録部位と大腿骨記録部位（右）の間の直接距離を測定する。 次に、心電図電極を装着し、心電図複合体のR波を識別する。 次に、眼圧計を用いて、頸動脈と大腿動脈で脈波の到達と心電図のR波までの遅延を測定する。 すべての正しい測定値が入力され記録されると、メーカーのプログラムがPWVc-fを自動的に計算する。 同じ眼圧計を右腕の手首付近の橈骨動脈に適用して、脈波分析（PWA）を測定します。 測定は1拍ごとに同期して行われ、2重に記録される。 これらの記録から、製造元のプログラムが心拍数で調整した中心脈波指数（CAIxHR75）を自動的に決定する。

二次アウトカム

血圧

連続血圧監視装置（Criticare 506 N3; Criticare Systems Inc.、Waukesha、WI、USA）を用いて診察室血圧（収縮期および拡張期）と心拍を監視する。 治験責任医師は、PWVc-f測定の前に血圧を測定する。 仰臥位で15分以上順応させた後、診察室血圧を測定する。 最初の測定値は破棄し、過去3回の測定値の平均値を報告する。

腸内細菌叢

被験者には、試験日の1日か2日前に糞便サンプルを採取し、自宅の冷蔵庫で保管するよう依頼される。 そのサンプルを氷（冷却装置または氷を入れた袋）に入れてUMCGに持参してもらう。 検査当日、サンプルは直ちに-80℃で保存されます。 我々は、マイクロバイオームの多様性、特定の運用分類、および循環代謝物（フェニルアセチルグルタミン、トリメチルアミンオキシド（TMAO）、インドールプロプリオン酸（IPA）を含む特定の循環代謝物を調査し、それぞれ、以前に心血管イベントとメタボリックシンドロームに関連していた 。 糞便サンプル中の腸内細菌叢の構成は、16S rRNA V4-V5可変領域のPCR増幅とIllumina® MiSeqプラットフォームを用いたディープシーケンスで分析される。

身体測定

各試験日に、身体測定（靴と厚着をしない状態の体重と身体組成）を行い、参加者の特徴を把握する。 身体組成（例：脂肪量、除脂肪体重、細胞外水分、細胞内水分）は、生体電気インピーダンス分析（Bodystat Quadscan 4000®; Quadscan, Douglas, Isle of Man, UK）により測定されます。 測定は、患者を仰臥位で5分間、両腕を体幹と平行にし、両足を離した状態で行う。 電極部位はアルコールワイプで洗浄する。 電極は右手と手首に2つ、右足と足首に2つ設置する。

患者健康質問票

参加者は各試験日の前に患者健康質問票（PHQ-15）を記入してもらう。 PHQ-15は、PHQ全体から派生した体性症状の下位尺度である。 この質問票には、外来で報告される身体的苦情の90％以上を占める約15の身体症状または症状クラスターが含まれている。

臨床化学

血液サンプルは、UMCGの検査医学科で、通常の手順に従って分析されます。 血漿中のマグネシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、リン酸、尿素、総蛋白、アルブミン、クレアチニン、ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球、血小板、代謝リスクマーカー（トリグリセリド、総コレステロール、LDL-コレステロール、HDL-コレステロール、空腹時血糖、HbA1C）等が測定される。 さらに、尿中のカルシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、クレアチニンが測定されます。 マグネシウムの状態を決定するために、血漿マグネシウムレベルおよび赤血球内マグネシウムが、ルーチンの手順に従って測定される。 これらの日記は治験責任医師により完全性が確認される。

統計解析

正規分布のパラメータについては、データは平均値および標準偏差として示される。 非正規分布のパラメータは中央値（範囲）として提示される。 統計解析では、応答はフォローアップ値とベースライン値の差として定義して計算される。 動脈硬化に対するクエン酸マグネシウムの効果を評価する主要解析では、クエン酸マグネシウムとプラセボの反応の差を、結果変数のベースライン測定値を共変量として用いて検定する（1因子ANCOVA）。 動脈硬化に対する酸化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムの効果が、動脈硬化に対するクエン酸マグネシウムの効果に対して非劣性であるかどうかを二次分析として検定するために、以前の研究で発見された動脈硬化に対するクエン酸マグネシウムの効果サイズに基づいて、非劣性余裕（Δ）0.5m/秒が選択されます。 マグネシウムとプラセボ治療間の反応の差を評価するために、結果変数のベースライン測定値を共変量として使用した1因子ANCOVAが実施されます。 非劣性を証明するためには、硫酸マグネシウムとクエン酸マグネシウムの差および酸化マグネシウムとクエン酸マグネシウムの差の信頼区間の下限が、酸化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムがクエン酸マグネシウムサプリメントよりΔ以上悪くないと95％確信できるΔを越えてはならない。 治療効果は各時点（2、12、24週後）で1要因ANCOVAにより計算される。 差は、一次解析（確認的）ではP < 0.01、二次解析（探索的）ではP < 0.05で統計的に有意とみなされる。 統計解析は、SPSS 23.0 software for Windows (SPSS Incorporated, Chicago, IL, USA)を用いて実施する。 残差の正規性は、Shapiro-Wilk正規性検定を用いて調べる。 残差が正規分布でない場合、パラメータは対数変換される。 対数変換後も残差が正規分布しない場合は，ノンパラメトリック検定が使用される． 欠測データは推定値で置き換えられない。 無作為化により、交絡因子は均等に割り振られることが予想される。 したがって、交絡因子に対する調整は行わない。 一次解析では、intention-to-treatの原則を適用する。 次に、per-protocol解析（非遵守の被験者を統計解析から除外する）を行う。 非劣性を証明するためには、intention-to-treat解析とper-protocol解析の両方で、差の信頼区間がマージンを除かなければならない。 最後に、降圧治療を受けている被験者と降圧治療を受けていない被験者の動脈硬化に対するマグネシウムの効果を比較するサブグループ分析を行う予定である。 高血圧治療を受けている被験者では、時間とともに動脈硬化がより急速に進行する可能性があるため、降圧治療を受けている被験者では、マグネシウムが動脈硬化に対してより顕著な効果を持つかもしれないというのが我々の仮説である

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