DISCUSSION
Citrobacter is a significant cause of opportunistic infection; C. diversus has approximately 40% of presenting cases, while C. freundiirepresidents about 29%(11)-C. digitsはヒトの脳内におけるシトロバクター増殖と複製について述べた。 Citrobacterspp.は新生児髄膜炎を引き起こし、脳膿瘍を引き起こす特異な性質がある(8, 14)。 髄膜炎や脳膿瘍を引き起こすCitrobacter spp.の病原性はよくわかっていないが、他の髄膜炎原因菌と同様に血液脳関門を通過することが必要であると思われる。 本研究は、Citrobacterと血液脳関門の相互作用の可能性をより深く理解するために実施された。 C. freundiiをモデル細菌として選んだ理由は、細菌の遺伝子がより明確に定義されており、HBMECにおけるCitrobacterの侵入と複製の分子基盤に関する最終的な研究のためのゲノムライブラリーが利用可能であるためである。 C. diversusの脳脊髄液分離株を用いた実験でも同様の結果が得られ（データ未掲載）、これら2種のHBMECへの侵入の頻度とメカニズムが類似している可能性が示唆された。 内皮細胞にはタイトジャンクションが存在し、ピノサイトーシス活性が低いため、血液脳関門を通過する大元素が制限されている。 現時点では、C. freundiiが血液脳関門のどこに侵入するかは不明であるが、実験的血行性Citrobacter髄膜炎の乳児ラットモデルでは、脈絡叢はほとんど関与しないことが判明している(16)。 また、血液脳関門の最大の表面積を占めるのは微小血管内皮細胞であり、他の髄膜炎原因菌はin vitroで微小血管内皮細胞に侵入することが示されている（13, 20, 25）。 そこで、本研究ではHBMECを選択した。 組織培養浸潤アッセイと TEM 研究により，C. freundii が HBMEC に浸潤することを証明した． 様々な真核細胞阻害剤存在下で行った浸潤アッセイの結果から、C. freundiiのHBMECへの浸潤は、ミクロフィラメント、微小管、de novoタンパク質合成、エンドソーム酸性化に依存したプロセスであることが示唆された。 C. freundiiはin vitroで長期間にわたり細胞内で生存し、複製することが可能であることが、Extended invasion assayにより明らかになった。 TEM分析により、C. freundiiの細胞内位置は、単膜空胞様構造体内であることが明らかになった。 トランスウェル実験では、C. freundiiはHBMECの極性単層を通過することができたが、非浸潤性の大腸菌は通過できなかった。 さらに、我々の予備的なデータでは、C. freundiiは実験的血行性髄膜炎を起こした新生児ラットモデルにおいて血液脳関門を通過することが示されている（21）。 これらのことから，C. freundiiは液胞に侵入し，おそらく複製し，HBMECを通過して基底膜側に放出され，血液脳関門を通過するものと考えられる＜5751＞ ＜396＞ C. freundiiによる真核細胞の侵入はこれまでに報告されている（22，35）． しかし，C. freundiiによるHBMECの浸潤については，本報が初めての報告である． 不思議なことに、C. freundiiの侵入に必要な真核生物は、C. freundiiが侵入することが示されている細胞型と同様に多様である。 例えば、クラスリン被覆ピット阻害剤MDCは、本研究で示したように、HBMECを除く他のすべての細胞型（例えば、ヒト血管、腸、膀胱上皮細胞）のアッセイでC. freundiiの浸潤を阻害することが示されている。 さらに、これまで特徴づけられた他の髄膜炎原因菌は、微小管に依存し、MDCに感受性がある経路でHBMECに侵入する(20, 24, 27)。 クラスリン被覆ピット阻害剤MDCおよびウアバインは、すべての受容体を阻害することが示されているわけではない。したがって、C. freundiiのHBMECへの侵入に必要な受容体は、阻害剤MDCまたはウアバインの影響を受けない可能性がある。 これまでに収集された証拠から、C. freundiiのHBMECへの侵入は、MDCまたはoabain感受性の受容体を介した経路では起こらない可能性があるが、エンドソームの酸性化とde novoタンパク質合成の両方が必要であるように思われる。 現在得られているデータからは、2つの可能性が示唆される。 エンドソームの酸性化は、細胞内細菌の生存のための環境的トリガーとして必要なのかもしれない。 同様の要件は、サルモネラ菌の上皮への侵入についても特徴づけられている（26）。 あるいは、C. freundiiの浸潤が起こるためには、エンドソームの酸性化とタンパク質合成が、リガンドと受容体の複合体の分離、受容体の合成、HBMEC表面への受容体の提示に必要である可能性がある。 後者のシナリオは、他の侵入性病原体でも、侵入に必要な真核細胞接着分子の調節に生体の接触が必要である（例えば、Streptococcus pneumoniaeと platelet-activating factor receptor）ことを想起させる(2)。
微小管阻害剤（重合阻害剤と安定化剤の両方）存在下で行った侵入試験で、HBMECがC. freundiiを取り込む能力が著しく低下した。 抗α-チューブリン抗体を用いた共焦点顕微鏡実験により、HBMECがC. freundiiと接触した後に微小管が凝集していることが示された。 微小管の凝集は時間依存的であり、5分では凝集は見られず、15分ではほとんど見られず、C. freundiiとHBMECのインキュベーションの30分後には明確な凝集が観察された。 この微小管の凝集は、微小管阻害剤またはミクロフィラメント阻害剤で細胞を処理すると抑制された。 興味深いことに、微小管凝集の染色パターンは細菌結合と共局在せず、C. freundiiの結合を示さなかったHBMECの領域でも顕著な微小管凝集が見られた。 このことは、細菌とHBMECの接触が微小管の凝集をグローバルに刺激している可能性を示唆している。 微小管の凝集が、分泌された細菌因子の結果なのか、細菌がHBMECに結合することによるパラクライン反応なのかは、まだ不明である。 さらに、C. freundiiの結合に応じた微小管の凝集は、de novoタンパク質合成とエンドソームの酸性化を介して、想定される受容体の提示に関連している可能性がある。 細胞表面への、あるいは細胞表面からの多くの受容体の輸送が微小管に依存していることは、以前に明らかにされている(10)。 したがって、C. freundiiのHBMECへの侵入に対する微小管阻害剤の阻害効果の1つの説明は、薬剤がC. freundiiの侵入を媒介するHBMEC受容体の数を減少させている可能性があることである。
微小管は、多くの病原体（例えば、Neiserria gonorrheae、Haemophilus influenzae、腸管出血性大腸菌、および Campylobacter jejuni（4、9、22、23、29）の侵入に必要であることが以前から示されている。 これらの病原体は、微小管依存性の経路を通って侵入することはあっても、通常、細胞内では複製されないというのが一般的な考え方である(6)。 本研究で得られた拡張浸潤アッセイとTEM解析のデータは、C. freundiiがこの一般論の例外である可能性を示唆している。 また、細胞内複製細菌であるLegionella pneumophila(12)とは異なり、ミトコンドリアやリボソームが菌の近傍に出現していないことが確認された。 このことは、C. freundiiがこれらの小器官を利用して直接エネルギーを得ていないこと、あるいは（L. pneumophilaの場合のように）細胞内の生存と増殖に特定の宿主細胞タンパク質の動員を必要としない可能性を示唆している。 中枢神経系感染症に特に関連するが、大腸菌K1、GBS、S. pneumoniaeなどの他の髄膜炎原因菌も同様にBMECに侵入し（1、13、25）、侵入してトランスサイトーシスする（20、27）ことが示されているが、これらの菌がHBMEC内で複製することは見つかっていない。 前述のように、Citrobacter髄膜炎は、高い頻度で脳膿瘍を形成することが知られている。 シトカラシンDはC. freundiiのHBMECへの侵入を阻害したが、免疫染色ではC. freundiiとHBMECの相互作用によるマイクロフィラメントの再編成は検出されなかった（data not shown）。 さらに、HBMECをサイトカルシンDで前処理すると、共焦点顕微鏡で可視化したように、細菌に依存した微小管の凝集が抑制された。 これらの結果については、いくつかの説明が可能であろう。 バクテリア依存性の微小管凝集に対するサイトカルシンDの効果は、微小管ネットワークに対するマイクロフィラメント阻害剤の間接的効果に起因すると考えられる。 例えば、微小管はF-actinのアンカー構造として機能することが観察されている(28)。 したがって、マイクロフィラメントネットワークの破壊は、微小管ネットワークに影響を与え、その結果、微小管依存的なC. freundiiのHBMECへの浸潤に間接的に影響を与える可能性がある。 あるいは、C. freundiiのHBMECへの侵入において、アクチン依存性の侵入ステップが微小管依存性の侵入ステップに先行する可能性もある。 この最初のステップは、細菌がHBMECと最初に接触したときにマイクロフィラメントの再編成をもたらすかもしれない。しかし、これらのイベントは一過性であるかもしれず、免疫蛍光顕微鏡を用いた実験デザインでは、その発生を十分に検出できないかもしれない。 同様のことは、Yersiniainvasinを介した浸潤でも指摘されている(36)。 したがって、浸潤の初期段階がサイトカラシンDによって妨げられると、微小管に依存するその後の浸潤の段階は引き起こされない。 アクチンは、細胞質シグナル伝達だけでなく、アクチン結合タンパク質因子の細胞膜への移動にも機能することが、以前に示されている(19)。 また、シトカラシンDは、アクチン結合タンパク質の菌体侵入部位への移動を阻害することにより、サルモネラ菌の侵入を阻害する(7)。 C. freundiiのHBMECへの侵入の場合，アクチンのミクロフィラメントが細胞質シグナル伝達や細胞膜での細菌の侵入に必要であり，ミクロチューブが膜結合細菌を細胞膜から側底部へ（あるいは細胞内深部へ）輸送するのに必要かも知れない． このように、侵入のいずれかの段階で障害が生じると、「交通渋滞」が生じることになる。
以上の結果から、C. freundiiはin vitroでHBMECに侵入し、内部で増殖し、トランスサイトーシスできることが示された。 これらの表現型の遺伝的基盤を明らかにすることは、Citrobactermeningitisの病態生理に重要な洞察を与え、新規の治療および予防戦略の開発に役立つ可能性がある。 さらに、シトロバクターと他の髄膜炎原因菌との広範な分子的比較解析により、シトロバクターの脳膿瘍形成という特異な性質が明らかになる可能性があります
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