Back to Basics – What is an Immunoassay – Downloadable PDF Version
What is an immunoassay or ELISA?
Immunoassay is quick and accurate tests that can be used in site and in laboratory to detect specific molecules. イムノアッセイは、分子の特定の構造に結合する抗体の固有の能力に依存しています。 抗体は、動物が体内に侵入した異物（抗原）に反応して生成するタンパク質である。 抗体は血液や組織液の中に存在し、抗原に出会うといつでも結合する。 抗体は抗原、すなわち分析対象物の特定の立体構造に合わせて開発されるため、特異性が高く、その構造のみに結合する。 血液から精製されたモノクローナル抗体やポリクローナル抗体は、他の物質による干渉が少なく、特定の標的分子を検出・モニターする理想的なアッセイ試薬である。 代表的なELISA法には、抗体サンドイッチ免疫測定法、抗原ダウン免疫測定法、競合阻害測定法、迅速測定法の4種類があります。
抗体サンドイッチ免疫測定法
典型的な抗体サンドイッチ免疫測定法では、モノクローナル抗体がプラスチック製マイクロタイタープレートに吸着されます。 検体を加えると、プレート上の抗体が検体中の標的抗原と結合し、プレート内に保持される。 次のステップでポリクローナル抗体を加えると、この抗体もターゲット抗原（プレート上のモノクローナル抗体とすでに結合している）に結合し、それによって2つの異なる抗体の間で抗原の「サンドイッチ」が形成されるのである。
– 手順1：プラスチック製マイクロタイタープレートのウェルにモノクローナル抗体をコーティングバッファーで吸着させる（サンプルは添加しない）
– 手順2：サンプル（ヒト血液など、適切に希釈）をマイクロタイタープレートのウェルに追加する。 ステップ3：酵素標識ポリクローナル抗体を標的抗原（プレート上のモノクローナル抗体に結合）に結合させ、2つの異なる抗体間で抗原の「サンドイッチ」を形成させます。
-ステップ4：酵素標識ポリクローナル抗体を検出するための比色基質を添加すると、プレートに添加された元のサンプルに存在する標的抗原の量に比例した色のシグナルが発生します。
抗原ダウン（免疫試験）免疫測定法
抗原ダウン（免疫試験）免疫測定では、分析物はサンプルに見られる抗体と結合するのにコートが用いられます。 サンプル（ヒト血清など）を加えると、プレート上の抗原がサンプル中の抗体（例えばIgE）と結合し、ウェル内に保持される。 次にHRPで標識した種特異的な抗体（例えば抗ヒトIgE）を添加すると、プレート上の抗原に結合した抗体と結合する。 シグナルが高いほど、サンプル中に抗体が多く含まれていることを意味します。 抗原ダウン（免疫テスト）アッセイは、迅速検査として構成することができ、アレルギー疾患の診断によく用いられます。日常的に、患者の血液を異なるアレルゲンに対して検査し、患者がそのアレルゲンに対する抗体を持っているかどうかを確認します。 競合阻害アッセイは、標準的なELISA形式のように2つの抗体ではなく、1つの抗体の結合を必要とするため、小さな分析物の測定によく使用される。 2つの抗体が同時に低分子に結合しようとすると、立体障害が起こる可能性が高いため、サンドイッチアッセイフォーマットは実行不可能な場合がある。 競合阻害アッセイでは、サンプルと結合した分析物をサンドイッチアッセイのように段階的に添加しますが、古典的な競合阻害アッセイでは、これらの試薬は同時にインキュベートされます。 逐次競合阻害法では、96ウェルのマイクロタイタープレートにモノクローナル抗体をコートします。 試料を加えると、MoAbは試料から遊離した分析物を捕捉する。 次のステップでは、ビオチンまたはHRPで標識された既知量の分析対象物を加えます。 標識された分析物はプレートに吸着したMoAbにも結合しようとするが、サンプル中にあらかじめ結合した分析物が存在するため、MoAbへの結合が阻害される。 つまり、モノクローナルが既に試料中の非標識物質を結合している場合、標識物質はプレート上のモノクローナルに結合することはない。 サンプル中の未標識物質の量は、標識物質が発するシグナルに反比例する。 シグナルが低いほど、試料中の未標識物質の量が多いことを意味する。 非標識物質の標準物質を連続的に希釈し、標準曲線を作成することができる。 その後、サンドイッチ ELISA 法と同様に標準曲線からサンプルの値を読み取ることができる。 競合阻害アッセイでは、標識（結合体）と非標識（サンプル）の同時添加が必要です。 標識物質と非標識物質の両方が、プレート上のモノクローナル捕捉抗体の結合部位をめぐって同時に競合する。 逐次競合阻害法と同様に、着色されたシグナルはサンプル中の非標識標的物質の濃度に反比例している。 標識された分析物の検出は、TMBのようなペルオキシダーゼ基質を用いることにより行うことができ、マイクロタイタープレートリーダーで読み取ることができる。
Rapid Immunoassay
マイクロタイタープレートの他に、家庭用妊娠検査など迅速検査として免疫測定法が構成されることもある。 ラピッドテストはマイクロタイタープレートアッセイと同様に、抗原と反応する抗体を用い、MoAb-PoAbサンドイッチ形式、競合阻害形式、抗原ダウン形式として開発することができる。 迅速検査では、抗体と抗原試薬が多孔質膜に結合しており、陽性検体と反応し、余分な液体は膜の非反応部分に流される。 ラピッドイムノアッセイには、試料をウェルに入れるだけですぐに結果がわかるラテラルフロー方式と、試料をウェルに入れ、ウェルを洗浄し、最後にコロイド金錯体を加えて数分後に結果を読み取るフロースルー方式がある。 1つのストリップまたはカセットにつき、1つのサンプルが検査されます。 迅速検査はマイクロタイタープレートアッセイよりも速く、サンプルの処理がほとんど必要なく、安価であり、機器を使用せずにYes/Noの答えを出すことができるので、実験室以外の人が現場で全サンプルを検査する際によく使用される。 しかし、迅速免疫測定法は感度が低く、分析対象物を正確に定量することはできない（糖尿病患者による血糖値の自己測定は定量的迅速検査とみなされるが、これらの検査には免疫測定技術は使用されない）。 すべての迅速免疫測定法はマイクロタイタープレートアッセイに変換することができますが、すべてのマイクロタイタープレートアッセイが迅速検査に変換できるわけではありません
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