DEAE-Sephadexなどの樹脂のスラリーをカラムに流し込みます。 使用されるマトリックスは、共有結合している荷電基を持つ不溶性のものです。 これらの荷電基は陽イオン交換体や陰イオン交換体などの交換体と呼ばれる。 沈殿した後、タンパク質混合物を適用する前に、カラムはバッファーで予め平衡化される。 DEAE-Sephadexはプラスに帯電したスラリーであり、マイナスに帯電した原子と静電的な相互作用を起こし、目的のサンプル中のプラスに帯電した分子よりも遅れて溶出するようになる。 これは、特定のタンパク質、あるいは体内の酵素を発見するために広く使われている分離技術である。 結合していないタンパク質は、フロースルーやその後のバッファー洗浄で回収される。 プラスに帯電した樹脂に結合したタンパク質は保持され、2つの方法のいずれかで溶出させることができる。 まず、溶出バッファー中の塩濃度を徐々に上げていく。 塩溶液中の負イオン（例えばCl-）は、タンパク質と競合して樹脂に結合する。 もう一つは、溶液のpHを徐々に下げていき、タンパク質がより正電荷になるようにして、樹脂から放出させる方法である。 これらの方法はいずれも、負に帯電したタンパク質を置換し、緩衝液で試験管に溶出させるものです。
タンパク質の分離は、全電荷の違いに依存します。 イオン化可能な側鎖の組成が、特定のpHにおけるタンパク質の全電荷を決定します。 等電点(pI)では、タンパク質の全電荷は0であり、マトリックスに結合することはありません。 pHがpIより高い場合、タンパク質は負の電荷を持ち、陰イオン交換カラムのマトリックスに結合します。 pI以上またはpI未満でのタンパク質の安定性により、陰イオン交換カラムと陽イオン交換カラムのどちらを使用すべきかが決定されます。 pI以下のpH値で安定であれば、カチオン交換カラムを使用します。 pI以上のpH値で安定であれば、陰イオン交換カラムを使用することができます
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