免疫染色は、抗体を用いて細胞や組織中の抗原を検出する方法です。 免疫組織化学（IHC）における免疫染色の主な利点は、空間的なコンテキストと組織の構造を維持しながら、組織サンプル内の目的のターゲットを見ることができることです。 簡単な定義
Types of Staining
免疫染色は、直接または間接的に行うことができます。 アプリケーションバリデーション済みの抗体を多くの蛍光色素にコンジュゲートすることで、直接標識することができます。
抗原の発現レベルやアクセス性により、直接結合では目的の標的を可視化できないことがあります。 このような場合、二次抗体を用いた間接的な標識が行われます。
IHC染色の例
CSTで実施したIHC染色の例を以下に示します。
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: IHC analysis of paraffin-embedded human lung carcinoma using PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb によるパラフィン包埋ヒト肺癌の IHC 解析。
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326.X: PD-L1 (E1L3N®) XP Rabbit #13684: IHC Analysis of paraffin-embedded human lung carcinoma using PD-L1 (E1L3N®) EP® mAb.X: IHC analysis of Paraffin-Employed Human lung carcinoma (E1L3N®) VP® Rabbit mAb #13684.X CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAbを用いたパラフィン包埋ヒト乳癌のIHC解析.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb を用いたパラフィン包埋ヒト乳癌の IHC 解析。
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Leica® Bond™ Rxで実施したα-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAbによるヒト内膜癌のパラフィン包埋IHC解析の様子です。
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: IHC analysis of paraffin-embedded human endometrioid carcinoma using α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb on the Leica® Bond™Rx.Inc （ライカボンドXP®ラビットマークの使用、ヒト内膜癌のパラフィン包埋
免疫組織化学（IHC）染色はどのように行われますか？
Tissue Preparation
組織の採取、保存、固定の手順はサンプルや対象物によって異なります。 組織の収集と固定は、サンプルの完全性と実験結果に直接影響します。
ホルマリンなどの架橋固定剤は、組織の構造的完全性を維持し、組織構造の維持を助けるため、IHC用のサンプルを準備するためによく使用されます。
Antigen (Epitope) Retrieval
組織サンプルの構造的完全性を維持するために使用される固定剤は、抗体が認識するように設計されたエピトープを埋めてしまうという欠点も持っている。 プロテイナーゼKのような酵素に依存するタンパク質分解誘発抗原検索や、熱を利用して架橋結合を切断し、タンパク質をほどく熱誘発エピトープ検索（HIER）などがある。 どちらの方法でもエピトープのマスクを除去することができ、一次抗体へのアクセスが可能になり、IHCによる染色に適した状態になります。 しかし、当社の科学者は、各抗体をIHCで使用するための最適な条件を決定するために、複数の抗原賦活法をテストしています。
Antibody Binding
正しい抗体を選択することは、IHCの結果を成功させるために最も重要なステップの1つです。 CSTのIHCバリデートされたすべての抗体は、組織内で強いシグナルを持つことが確認されているだけでなく、シグナルの特異性を確認するための厳しいバリデーション手順が実施されています。
こちらをクリックすると、IHC Validated Antibodies for your targetを閲覧できます。
Detection Systems
免疫組織化学（IHC）染色では、2種類の幅広い検出が可能です。 1) 発色性、2) 蛍光性。 発色検出では、ビオチンベースのシステムの制限を回避し、アッセイの感度を向上させるポリマーベースのシステムの使用を推奨しています。
一次抗体の宿主種に応じて、SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, rabbit) #8114 または SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, mouse) #8125 をお試しください。
ポリマーベース検出はビオチンベースシステムより感度が高いです。 Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579とビオチンベース検出（左）またはポリマーベース検出（SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114；右）を用いたパラフィン包埋ヒト肺癌のIHC解析。 4048>
ポリマーベースの検出は、ビオチンベースのシステムよりも感度が高く、より強固な染色が得られます。 Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579とビオチンベース検出（左）またはポリマーベース検出（SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114、右）を用いたパラフィン包埋ヒト肺がんのIHC解析。
すべてのDAB基質が同等の性能を発揮するわけではありません。 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 を用いたパラフィン包埋ヒト乳癌の IHC 解析です。 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059（左）、競合他社製DAB（中央）、競合他社製DAB（右）を使用して発色検出を行った。 競合2社のDABはSignalStain® DAB Substrate Kitと同等のシグナルを示しますが、競合1社のDABはかなり弱いシグナルとなりました。
すべてのDAB基質が同等の性能を示すわけではありません。 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 を用いたパラフィン包埋ヒト乳癌の IHC 解析です。 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059（左）、競合他社製DAB（中央）、競合他社製DAB（右）を使用して発色検出を行った。 競合品2のDABはSignalStain® DAB Substrate Kitと同等のシグナルを生成しますが、競合品1のDABではシグナルがかなり弱くなります。
Counterstaining
抗体検出後、多くの研究者は細胞構造を視覚化し特定の染色を見る人の方向付けるために組織のカウンターステインを好みます。 CSTでは、核を青く着色するHematoxylin #14166を使用してサンプルを対比染色しています。 対比染色を選択する場合、対比染色が使用する発色剤に適合していることが重要です。
Immunohistochemistry (IHC) Staining Protocol
以下は、当社が推奨するプロトコルの概要で、実験を成功させるための重要なステップをハイライトしています。 CSTは、バリデートされた抗体および試薬を提供することにより、お客様のIHC分析の向上を支援することを目的としています。
IHCプロトコルビデオを見る、またはプロトコル選択ページをご覧ください。