Abstract
Object. 受験ストレス下の若年成人におけるLactobacillus plantarum 299vの唾液中コルチゾールおよび唾液中IgA濃度への影響を明らかにすること。 デザイン 学力試験を控えた学生41名を対象とした無作為化二重盲検プラセボ対照試験。 プロバイオティクス細菌またはプラセボ製品が14日間、1日1回カプセルで投与された。 唾液を採取し、各サンプリング時に知覚ストレステストに記入した。 唾液は、電気化学発光免疫測定法（ECLI）によるコルチゾール分析のために採取され、唾液中のIgAは酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）により分析された。 乳酸菌の量は、唾液を選択培地で培養して評価し、L. plantarum 299vの同定は、ランダムに選んだコロニーをランダム増幅多型DNA（RAPD）タイピングで行った。 結果 治療群とプラセボ群との間でコルチゾールレベルに有意差が認められ、併せて治療群ではプラセボ群に比べ乳酸菌レベルが有意に増加した（）。 唾液中IgAについては、有意な変化は認められなかった。 結論 過敏性腸症候群（IBS）の症状を軽減する能力を持つプロバイオティクス細菌は、検査期間中のストレスマーカーであるコルチゾールのレベル上昇を禁じた。 本試験の登録番号はNCT02974894で、ClinicalTrials.gov.
1 に登録されている。 はじめに
消化器と生理的ストレスには関係があり、唾液コルチゾールと唾液免疫グロブリンA（唾液IgA）はストレスのマーカーとして捉えることができます . コルチゾールはストレスに反応して副腎から放出されるステロイドホルモンで、そのレベルの上昇は免疫系の抑制に関係しています。 唾液中IgAは、口腔免疫防御の一部であり、唾液中に最も多く存在する抗体で、主に分泌型IgAの形で存在しています . 口腔粘膜全体に存在する小唾液腺は、成人の全唾液に含まれる唾液性IgAの約30～35％を分泌しています。
プロバイオティクスは、「適切な量を投与されたときに宿主に健康利益を与える生きた微生物」と定義されています。 L. plantarum 299v は、これまでの研究で、過敏性腸症候群 (IBS) の症状である腹部膨満感や痛みに対してポジティブな効果を示すことが分かっています。 また、この菌株は、ストレスに対する視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸の反応を抑制する可能性のある腸のリークネスに対抗することが示されている。 L. plantarum 299v のストレス関連疾患に対する効果については、これまで研究が行われていません。 しかし、母親との分離によってストレスを受けたラットの仔を対象に、Lactobacillus rhamnosus R0011 と Lactobacillus helveticus R0052 のプロバイオティクス混合物が動物の血中のコルチコステロン（コルチゾール類似物質）のレベルを著しく低下させたことが示されている . また、急性の時間制限のあるストレス要因にさらされたラットは、Lactobacillus farciminisで処理した後、血中のリポポリサッカライド（LPS）のレベルが低下するとともに、ストレスが減少した。
唾液採取は簡単かつ非侵襲的で、検査対象者に害や不快感を与えることがない方法にもかかわらず、唾液中のストレスマーカーに対するプロバイオティクス細菌の効果についてはあまりわかっていない。 このことは、ストレスマーカーを評価する際に、急性の上昇が試験で評価した急性のストレス要因ではなく、サンプリング方法によるものである可能性がある場合、特に重要である。 唾液中IgA濃度に対するプロバイオティクスの効果に関しては、ほとんどの研究が様々な呼吸器感染症の発症に関連しており、以前の研究では、L. rhamnosus HN001を含む製品を摂取した子供のグループでは、プラセボグループと比較して便中の分泌IgA濃度が増加したと報告されている 。 また、L. rhamnosus GG株でも同様の結果が得られました。
慢性ストレスはコルチゾールレベルの上昇と関連していますが、コルチゾールが生理的ストレス反応の原因物質であるか、単なる結果であるかは議論の余地があります … 。 コルチゾールの放出は急性ストレスに対する遅延性の末梢反応であり、コルチゾールは生体のストレス反応に対して刺激作用と抑制作用の両方を発揮することが示唆されている。 刺激作用の例としては、心血管系の活性化が挙げられる。しかし、例えば出血のストレス要因に対しては、コルチゾールは、血管収縮性のストレスホルモンの最初の急激な分泌を抑制することにより、体液量の減少反応を抑制している … コルチゾールの免疫調節作用については、その分泌が、ストレスに反応して起こる免疫反応の「オーバーシュート」を防いでいることが示唆されています。 しかし、ストレスに対する身体の反応において、コルチゾールレベルの上昇がどのような目的で行われているかはまだ明らかになっていない。
本研究では、検査ストレスを受けた若年成人の唾液コルチゾールレベルに対するプロバイオティクス細菌Lactobacillus plantarum 299vの効果を明らかにすることを主目的としている。 ストレスの代替マーカーとして、小唾液腺およびヒトの全唾液中の唾液IgAを測定した。 仮説は、受験ストレスによりコルチゾールレベルが上昇すると予想されるプラセボ群に比べ、試験群ではコルチゾールレベルが低下または安定化することであった。 一方、唾液中IgA濃度は、プラセボ群に比べ、試験群では増加することが予想された。 Study Design
今回の無作為化二重盲検プラセボ対照試験では、ルンド大学の18歳から30歳の学生を対象に、試験期間中にボランティアで参加してもらいました。 除外基準は、妊娠、試験期間中の抗生物質や一時的なコルチゾン薬の摂取であった。 被験者の人数を決めるために検出力計算を行った結果、40人で十分であると判断された。 健康な若年成人42名（女性28名、男性14名）がこの研究に志願し、参加者全員がインフォームドコンセントに署名してくれた。 男性1名の脱落者を経て、41名が全実験期間を終了した。 21人には1日量1 1010コロニー形成単位のL. plantarum 299vのカプセル（L. plantarum 299v, potato starch, hydroxypropyl methyl cellulose, and magnesium stearate, (Probi AB, Lund, Sweden) ）を、20人には菌を除いて試験品と同じ成分を含むプラセボのカプセルを投与しました。 実験期間開始前に2週間のウォッシュアウト期間を設け、プロバイオティクス製品の摂取を控えるよう指導した。 その後、1日1回昼食後にカプセルを摂取し、摂取後1時間は飲食、喫煙、スナッフの摂取を控えるよう指示した。 また、カプセルの粉末が口の中で溶けるまで噛む（最低30秒）か、スプーンの上にカプセルを空け、粉末を30秒噛んでから摂取するよう指示した。 すべての参加者の基準試料は、製品を摂取する前の0日目に採取されました。 試験は14日間行われ、開始日は1.5週間以内に参加者全員について個別に決定された。 心理アセスメント
被験者が自己認識するストレスを評価するために、心理アセスメントを実施しました。 Levensteinらによって開発された30問の質問票を使用し、得られたスコアが低いほどストレスの程度が低いことを示し、その逆もまた然りである。 0から1の間の数値を与える指標は、次のように計算された：
2.3. 唾液の採取
小唾液を前述したように下唇粘膜部から採取し、同じ採取日に全唾液を採取した。 採取時の唾液分泌の概日変動の影響を軽減するため、全てのサンプリングは午後3時から5時の間に行われた。 0日目と14日目は全サンプルを採取し、5日目と10日目はコルチゾールのサンプルのみを採取した。 被験者には、サンプリング時刻の1時間前から飲食、嗅覚、喫煙、歯磨き、いかなる運動もしないように指示した。 また、サンプル採取の12時間前からアルコールも禁止された。
2.4. コルチゾール分析
コルチゾール分析のための唾液の採取は、コルチゾール用Salivette®（ドイツ、Sarstedt社製）を用いて行い、IgA分析のための唾液採取の後に実施された。 参加者は、口の中で2～5分間、唾液でいっぱいになるまでスワンプを循環させ、その後、注意深くチューブに吐き戻すように指示された。 チューブは氷上に置かれ、その後、分析まで-20℃で凍結された。 コルチゾール分析は、Labmedicin Skåne（スウェーデン、スコーネ地方の大学および地域の研究所）が行い、認定に従って実施された。 使用した方法は、ルテニウム（Ru）誘導体.
2.5 に基づく検出技術 Electrochemiluminescence Immunoassay（ECLI）による1ステップ競合アッセイであった。 唾液中IgAの分析
下唇からSialoPaper® strip (Oraflow Inc., New York, USA) で小唾液を採取し、粘膜上に60秒間静かに置き、その中の唾液量をペリオトロン® 8000 (Oraflow Inc., New York, USA) で測定しました。 SialoPaperストリップを氷上で1 mLのPBS（1.5 mL PP, Sarstedt, Germany; Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A, Oxoid, England）に入れ、分析まで-80℃で保存した。 小腺唾液をサンプリングした後、非刺激性全唾液を採取した。 参加者は座った状態でやや前傾姿勢をとり，滅菌ストローを用いて唾液を2 mLマイクロチューブに排出した（1 mL滅菌使い捨てピペット，ケミカリア，スウェーデン；2 mL PP，サルステッド，ドイツ）． すべてのサンプルは分析まで-80℃で保存した。
唾液中に分泌されるIgAの濃度は、総タンパク量に対する相対値であるため、単位% IgA/total proteinが唾液全体の分析結果を表すために選択される。 これは、IgAの分泌量が唾液流量によって変化し、それが自律神経系への刺激、例えば、急性ストレス、慢性ストレス、安静などによって変化することに関連しています。 この流量変化は、唾液中のIgA/総タンパク質の割合の測定によって説明されるため、異なる被験者のデータを比較する際に正確な方法となります。 St Louis, MO, USA）をアルカリホスファターゼ（Sigma A9669; PBSTで1 : 30,000に希釈）にコンジュゲートさせた。 総タンパク質濃度は、クイックスタートプロテインアッセイ（BIO-RAD）.
小腺の唾液中IgAは、mg/100mLとして表した。 唾液中IgAの分析は、マルメ大学歯学部（スウェーデン・マルメ市）にて行った。
2.6. 乳酸菌のプレートカウント
口腔内の乳酸菌を分析するために、被験者はパラフィンペレット（オリオンダイアグノスティックス社製）を噛んで唾液の分泌を促し、唾液全体のIgAと同じ方法で採取しました。 この唾液サンプルの採取は、他の方法とは異なり、このサンプリング方法では強く刺激された唾液が得られるため、各サンプリング機会の最後に行った。 氷上で0.25 mLを別の滅菌マイクロチューブ（1.5 mL PP, Sarstedt, Germany）に移し、0.5 mLの凍結培地を入れた。 両チューブは分析まで-80℃で保存した。
乳酸菌の多さはプレートカウントで評価した。 試料を希釈してRogosa寒天培地プレート（Oxoid, England）に広げ、嫌気条件下（2.5 L, AnaeroGen™, Oxoid）で37℃、72時間インキュベーションを行った。 各プレートから2つのコロニーを無作為に選び、再培養した。 分離株は凍結培地で-80℃にて凍結保存した
2.7. L. plantarum 299vの同定
各単離株のDNA抽出は、試料を解凍してボルテックスした後、1mLの滅菌MilliQ水を加え、最大速度で遠心分離（14 800 g、1分間）した。 上清を除去し、さらに 0.25 mL の滅菌 MilliQ 水を加えた。 残りの細胞抽出液を滅菌Assistent®ガラスビーズ（Ø 2 mm, Glaswarenfabrik Karl Hecht, Germany）でシェーカー（6℃, 30分）で滑らかに粉砕し、すべてのサンプルをランダム増幅多型DNA（RAPD）反応に使用し、L. plantarum 299vの出現を検討した。 175 μL buffer (Qiagen, Germany), 35 μL dNTP (Roche Diagnostics, Germany), 35 μL Primer 73 (Qiagen, Germany), 8.75 μL Taq-Polymerase (Qiagen, Germany) を含む35試料分のマスターミックスを調製した． マスターミックス 7.25 μL を各 PCR チューブ (Gene Amp 0.5 mL, Applied Biosystems, Singapore) に 42.75 μL の H2O とサンプルの上清 1 μL と共に加えた。
RAPD 反応は Quednau らに従って PCR 機 (Perkin Elmer, DNA Thermal Cycler, USA) で行った。 ゲル電気泳動用のゲルは、0.75 g Agarose DNA Grade Electran® (VWR, Belgium) を50 mL TB buffer に加え、沸騰するまで加熱した後、ゲルタンクに注いで冷却して調製した。 最後にゲルをTBバッファーとともにゲルトレイに入れた。 各サンプル2-5μLを3μLのローディングバッファーと共に各ウェルに加え、電気泳動を行った（100V、1時間）。 Gel Redx3 (Biotium Inc., USA), 1 mL in 99 mL dH2O を20分間使用してゲルを着色し、Quednau et al.に従って写真撮影を行った。 統計計算
データは、Kruskal-Wallis One-Way Analysis of Variance (ANOVA) on Ranks、または必要に応じてMann-Whitney Ranks Sum testを用いて統計的に評価された。 絶対IgA濃度および絶対コルチゾールレベルの一対比較にはA-検定を使用した。 統計ツールはSigma Plot（11.0および12.0）およびExcel 2013を使用した。 また、L. plantarum 299v の発現に関する罹患率検定は QuickStat (2.6) を用いて Fisher Exact 検定で実施した。 データは中央値と四分位範囲、および平均値と標準偏差で示した。 コルチゾールサンプルの最小値と最大値は、データに明確な逸脱が見られるため、外れ値の影響を排除するために削除した。 これはコルチゾールのサンプルにのみ関係する。 研究要件をすべて満たしていない参加者に属する値がコントロールされ、逸脱は認められなかった。 したがって、その結果も含まれる。 倫理的許可
本研究はルンドの地域倫理審査委員会により承認され（Ref 2013/166）、倫理的配慮には使用製品による利益とリスク、責任ある試験担当者と試験を行う被験者の間にすでに存在する個人的関係の可能性が含まれた。 結果
3.1。 心理アセスメントの評価
心理アセスメントでは、群間で知覚ストレスの有意差はなく、さらに各群内でサンプリング日の違いを比較しても有意差はなかった
3.2. 唾液中のコルチゾール濃度
基準日（0日目）のコルチゾール絶対値（nM）はプラセボ群9.18（±2.50）、試験群9.47（±2.96）で、両群に有意差はなかった()。 コルチゾール中央値の相対的変化を0日目（ベースライン）の基準値と比較したところ、10日目に群間で有意差が認められた（；図1）。
基準日（0日目）の小腺唾液中のIgA絶対値（mg/100mL）はプラセボ群1.99（±3.76）、試験群4.80（±9.17）で、両群間に有意差はなかった（ ）内はプラセボ群、試験群ともIgA値（mg/100mL）であった（ ）内は試験群、試験群は小腺唾液中IgA値（mg/200mL）を示した。 基準日（0日目）の全唾液中のIgA絶対量（％IgA／総蛋白）は、プラセボ群25.3（±7.37）、試験群27.1（±12.2）であり、両群間に有意な差はなかった（）。 コルチゾール値の変化とは対照的に、全唾液または小唾液腺からの唾液中の唾液IgA濃度の中央値は、プロバイオティクス摂取の影響を受けず、すなわち、プロバイオティクス群とプラセボ群の間に有意差は認められなかった（図2および3、それぞれ。
3.4. 乳酸菌の生菌数およびL. plantarumの同定 299v
14日目に、プラセボ製品を与えられたものと比較して、プロバイオティクスを摂取した被験者の唾液中の乳酸菌の存在量に有意な増加があった（）。 また、ベースラインと最終サンプリング日を比較すると、プロバイオティクス群内でも有意に増加した（、図4）。 L. plantarum 299vと同定された分離株の発生率は、プラセボ群とベースラインの両方で、乳酸菌が検出可能なレベルの人で14日目に有意に増加した（）
ほとんどの参加者が試験終了前に試験を受けたため、プラセボ群では10日目に知覚ストレスのピークが見られたが、有意ではない（）。 これは、プラセボ群における10日目の唾液中コルチゾール濃度のピークと一致する（図1）。 一方、プロバイオティクス群ではピークが見られなかったことから、プロバイオティクス摂取が副腎からのコルチゾールの分泌として見られるストレスに影響を及ぼしていることが示唆された。 14日目には、ボランティアの多くが試験を終えており、コルチゾールは急性のストレス要因に比較的早く反応するため、コルチゾールの減少が予想された。
ここでは試験期間という形で、学業ストレスは、参加者がストレス期間の終了を確認できるので、慢性ストレスとは見なせない。 したがって、学業ストレスはストレス反応に関しては急性ストレスに近いことが示唆される。 本研究のコルチゾール値は、これまで報告されてきた急性ストレスと同じ範囲であった
慢性ストレスは、コルチゾールの分泌が持続的に増加することに関連している。 慢性ストレスに関連する多くの疾患や症状の原因は、実際にコルチゾールのレベルが上昇したことなのか、むしろ、ターゲット組織がレベルの上昇にどのように反応するのか、最近になって議論されています。 しかし、血糖値の上昇が長期間続くと、筋肉の消耗、脂肪の蓄積、再分配が起こり、糖尿病になる可能性があることが知られています。 したがって、プロバイオティクスのターゲットとなり得るのは、慢性的にストレスを受けている人々であり、コルチゾールレベルの持続的な上昇は、慢性的ストレスに関連する疾患の発症リスクを増加させる。 しかし、異なるグループの中央値は、他の人が報告した値とよく対応している。 今回の全唾液サンプルの結果では、プラセボ群と試験群との値に有意差はなく、両群の中央値はほぼ同じであった。 各群の相対的な変化を見ると、中央値はプロバイオティクス群でわずかにプラス、プラセボ群でわずかにマイナスであった。 25%および75%で比較すると、検出された唾液中IgA濃度の大部分はプラセボ群で増加しており、結論を出すのは難しい状況です（図2）。 慢性的なストレスを引き起こすストレス因子は、唾液中IgA濃度の低下と関係があるとされているが、急性ストレスは濃度の上昇を示し、これは免疫反応の活性化を示している。
これまでの研究では、プロバイオティクスがストレス時の唾液中IgA濃度を増加させることを示唆する傾向がありました。 しかし、本研究の被験者のプロバイオティクス摂取期間は2週間であり、このグループの乳酸菌レベルが有意に高かったにもかかわらず、個人レベルで明確な変化を見るには研究期間が短すぎた可能性があります。 唾液中IgA濃度の個人差が大きいため、各群の参加人数を増やすことも望ましいと考えられた。
小腺の唾液中IgA濃度が他の報告より高いことがわかったが、これは個人差によるものか、この研究の研究デザインによるものである可能性がある。 例えば、被験者に一定のストレスレベルやストレスタイプが適用されているが、Sonessonらの研究では適用されていない。 小唾液のデータでは、中央値はプラセボ群より試験群の方が高かったが、群間の差は有意ではなかった。 プラセボ群に比べ、プロバイオティクスを投与した群では増加量が大きいように見えるが、中央値の相対的な変化は両群でほぼ同じである。
学業ストレスを含む短時間の自然主義的ストレスは、ストレスマーカーの増減に関して、急性ストレスと慢性ストレスの中間に位置することが予想されます。 ストレスの種類を定義することは困難であり、参加者それぞれに与えられたストレスは異なる可能性があるため、今回見つかった有意差は、IgAがストレスを反映するという理論に合致しています。 他の研究では、ストレスを経験した後、しばらくしてIgAレベルが低下することが確認されているので、研究期間を長くするか、研究後1～2週間後に追加のサンプルを採取すれば、唾液中IgAの変化を観察することが容易になったかもしれない。 もう一つの理由は、参加者に健康状態の変化（例えば、風邪をひいたなど）を書き留めるよう指示したにもかかわらず、このことがコントロールされず、唾液中IgAデータの異常値と比較されなかったことであろう。 風邪やその他の呼吸器感染症は、おそらく唾液中IgAの増加を引き起こすと思われます。IgAは、病原体に対する免疫システムの最初の防御ラインの一部であるため、
プロバイオティクスグループの乳酸菌レベルは、プラセボグループと比較して有意に増加し、投与した細菌が口腔内で生存できることを示していました（図4）。 このことは、RAPD-typingの結果からも裏付けられ、乳酸菌レベルが検出限界以上であったサンプルにはL. plantarum 299vが存在していることが示された。 このように、プロバイオティクス細菌の存在の増加と唾液中のコルチゾールレベルの低下との間には関連があるようである。 結論
プロバイオティクスを投与した被験者とプラセボを投与した被験者の間には、おそらくストレスに関連して、コルチゾール分泌反応に有意差があることが判明した。 さらに、プロバイオティクス群ではプラセボ群に比べ、乳酸菌のレベルで有意な増加が見られた。
利害関係者
Irini Lazou AhrénはProbi ABの従業員です。 製品およびプラセボカプセルはProbi AB社から提供されました。 その他の競合利益は報告しない。
著者らの貢献
2人の筆頭著者、Hannah AnderssonとCecilia Tullbergは本論文に等しく貢献し、筆頭著者を分担した。
謝辞
著者らは実験室の支援についてLund大学のJie XuとMarie Kalaに感謝する。