アミノ酸の影響を受けたヌクレオチドおよびヌクレオシドの統合的合成

糖化産物の同時生成

単純な前駆体からヌクレオシドおよびヌクレオチドの構造を3塩基で同時に脱水合成することを実現しました。 これは、特定の生成物を好むように条件を最適化した、この分野の以前の研究とは対照的である24,25,26。 典型的なグリコシル化実験では、アデニンとP-リボースを90℃で5時間、pH 2.5で加熱した。 アデニンとP-リボースが結合すると、アデニン一リン酸（AMP）ヌクレオチド（およびその異性体）が生成することが確認された。 生成物をHPLC-MSで分析して得られた抽出イオンクロマトグラム（EIC）には、m/zが＋と＋に一致するピークがいくつか見られた（補足図13〜15）。 標準品との比較から、AMPはRT = 4.2 minに見られるピークに対応することが確認された（補足図5、6）。他の主要ピークは、N6-リボシル化異性体など、AMP異性体に一致する可能性がある。 このことを確認するために、N6-リボシル化異性体は加水分解を受けやすいと考え、NaOH (0.1 M) 存在下で加水分解反応を行い、異性体の違いを識別することを試みた。 しかし、ピークにわずかな乱れが観察され、N6-リボシル化異性体の確認は困難であった。 そこで、異性体の溶出プロファイルを明らかにするために、2種類の異性体（アデノシン3′-一リン酸およびアデノシン5′-一リン酸一水和物）の純標準を単独および混合して分析した（補足図148, 149）。 標準混合物では保持時間のシフトが観察され、実サンプル中のこれらの化合物の溶出とより良い相関が得られました。 異性体の区別は困難ですが、標準混合物の溶出プロファイルを実試料と比較することで、AMP生成物の中に少なくとも2つの異性体が存在することが確認できます。 同じ質量のヌクレオチドが異なる保持時間で溶出する理由として、異なる異性体の形成（補足図12）が考えられることが明らかとなった。 さらに、我々の反応生成物のMS/MS分析により、AMP（およびその異性体）はアデニン（m/z = 136.0617 ± 0.01）にフラグメンテーションされ（補足図20）、これは標準AMPのフラグメンテーションと一致します。

時間経過反応から、水の蒸発がグリコシル化生成物形成の主要な駆動力であることがわかり、2〜4時間の間にヌクレオシドおよびヌクレオチド構造の形成が著しく増加した（図2a）。 これは、サンプル量が極端に減少し、試薬が極端に濃縮される時間帯に相当する。 5〜6時間反応させると、サンプルは乾燥状態になり、反応速度（その後、HPLC-MS測定における強度）は安定化する。 AMPのほか、環状ヌクレオチド（すなわちcAMP）27、ヌクレオシド（すなわちアデノシン）などのグリコシド結合含有生成物をRP-HPLC-MS、MS/MSを用いて検出し、標準品との比較により確認した1，N6-エテンオ誘導体の生成試験28，29（図2、補足図7～11、補足図23～27）。 2′,3′-cAMP および 3′,5′-cAMP の標準物質の保持時間 は、試料中の EIC ピークの保持時間と一致しなかった。 しかし、質量分布（+; +）とフラグメンテーションパターン（+）は同一であった（補足図16-21）。 これらの結果は、環状構造は形成されるものの、カノニカルcAMPは主生成物ではないことを示しています。 また、アデノシン分析標準物質との比較から、アデノシンはP-リボースとアデニンの縮合反応で多くの異性体とともに生成することが示されました（補足図18-22）。 これらの実験ではAMPとアデノシンの標準型が確認されたが、脱水反応の主要生成物ではなかった。

リン酸をピロリン酸として別途供給してアデニンおよびリボースと反応させると、アデノシンの質量を持つ化合物が検出され、AMPおよびcAMPが少量検出されて、リン酸源がない場合にもアデノシンが生成した（補足図33-41）。 我々は意図的にリン酸化生成物（AMP異性体およびcAMP異性体）の同定に研究を集中させ、AMP異性体およびcAMP異性体ではないリン酸化生成物の同定にはあまり注意を払わなかったことは注目に値する30,31,32。 我々は、リボースの水酸基とアデニンのアミノ基との間にグリコシド結合が形成され、それがきっかけで水分子が蒸発により失われることを提案している。 アデニンの一級アミンと二級アミンの相対的な反応性はよく研究されており33、活性化や保護基の存在なしに、通常一級アミンのグリコシド結合が優先される。 したがって、アデノシン/AMPの正準異性体は、第二級アミンのみでの反応を必要とするため、主要な生成物にはならないと考えられる。 しかし、2級アミン部位での反応性は十分に高く、主要生成物ではないものの、カノニカル異性体が形成されることが期待される。 グアニンなどの他の核酸塩基では、アクセス可能なアミン基がさらに多く、異性体生成の可能性はより大きい。 3522>

他の核酸塩基（シトシン，グアニン，チミン）とP-リボースとの反応性も調べた． グアニン、シトシンとP-リボースの脱水反応により、ヌクレオシド、ヌクレオチド構造に相当する質量が検出された（図3、補足図50〜64）。 グアニンのグリコシル化構造は、低pHでのグアニンの溶解度が限られているためか、比較的低い範囲でしか形成されなかった。 5-メチルウリジン一リン酸（m5UMP）と5-メチルウリジン（チミンヌクレオシド）の生成量は、グアニンやシトシンからの同等物よりもさらに低かった（図3、補足図65, 66）。 これらの結果は、グアニンとシトシンには一級アミノ基が存在し、チミンにはそれがないことによって説明できる。 3つの核酸塩基はすべて2級アミン基を持つが、これらはグリコシド結合の形成において反応性が低い。 したがって、一級アミンが存在する核酸塩基では、通常のグリコシル化産物の形成に必要な二級アミン反応によるヌクレオシドおよびヌクレオチド構造の形成が好まれない。 このことは、生命の起源における核酸化学の採用について興味深い示唆を与えている。なぜなら、正しい異性体への選択性を高める生化学的装置がさらに出現するまでは、正準核酸は当初不適当であったかもしれないことを示唆しているからである。 したがって、予想通り、シトシンとグアニンの標準的なヌクレオチドおよびヌクレオシド生成物は我々の実験で形成されたが、それらは観察された主要なピークに対応しなかった（補足図42-49）。 これらの2つの観察結果（保持時間は異なるが、EICにおける標準物質と同じ質量分布）を組み合わせることにより、グアニン/シトシンとP-リボースの脱水反応から生成したヌクレオチドおよびヌクレオシド種は主に標準ヌクレオチドおよびヌクレオシドの異性体種（いくつかの考えられる構造を補図に示す）だと結論することができる。 50, 51）。

P-ribose と核酸塩基からの他の生成物。 25mM P-リボース＋25mMヌクレオベースからなるすべての水性反応混合物を90℃で5時間加熱し、生成物をRP-HPLC-MSによって分析した。 シトシン、グアニン、チミンの糖化生成物の質量に対するEICの全ピーク面積の表現

通常、ヌクレオチド構造の形成は、特定の反応生成物をターゲットにして、用いる核酸塩基によって特定の条件下で行われてきた。 別のアプローチとして、P-リボースとの反応に複数の核酸塩基を同時に含ませることにした。 目的は、同じ反応条件下で、複数の核酸塩基による生成物形成が、混合して起こるのか、それとも1つの生成物に支配されるのかを明らかにすることである。 この反応は、2つまたは3つの核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン）を同時にP-リボースとともに反応容器に含ませて行いました。 ヌクレオチド（AMP、GMP、CMP）とそれぞれの環状ヌクレオチド（cAMP、cGMP、cCMP）およびヌクレオシド生成物（アデノシン、グアノシン、シチジン）からなるグリコシル化生成物の混合物が得られた（補図67〜95）。 グアニンの糖化産物はアデニンやシトシンに比べて低収量で生成したが、これはグアニンの酸性条件下での溶解度が低いためと予想される。

核酸塩基交換

シトシンまたはグアニンとともに酸性水溶液中でNa+AMPを90℃、5時間加熱すると、核酸塩基交換が観察された。 核酸塩基交換により、ヌクレオチド（CMPまたはGMP）、環状ヌクレオチド（cCMPまたはcGMP）、ヌクレオシド（シチジンまたはグアノシン）構造が生成した（補足図96-102、半定量収量は補足表1参照）。 この実験では、CMPとシチジンは強度が増加する傾向を示したが、cCMPは12.5 mMのときに最大強度となり、その後4.0 × 104 AUの強度まで低下した（補足図102a、155-158）。 シトシン濃度が37.5 mMのとき、強度の高い化合物はCMPであり、cCMPとシチジンの強度はほぼ同じであることがわかった。 CMPとcCMPのEICでは、主に2種類の異性体が観測された。 +CMPの場合は＋、＋、＋の質量が検出され、cCMPはそれぞれの質量分布内で＋、＋、＋が検出された。 シチジンの場合は、＋が主な検出ピークとなりました。 これらの質量分布は，標準品で観察された質量分布と一致した。 しかし、主な異性体の保持時間は、カノニカルCMPおよびシチジンとは一致しなかった。 AMPをグアニン濃度を上げながら反応させると（補足図102b）、3つのグリコシル化産物（GMP、cGMP、グアノシン）はいずれもグアニン濃度が2.5 mMのときに最大値に達した（補足図160-162）。 この結果は、酸性pHではグアニンの溶解度が制限されるため、反応容器に多くのグアニンを加えても、溶液中の有効濃度は同じであることの帰結であった。 最大値以降は、グアニンの溶解度が低いため、cGMPとグアノシンの強度は一定であった。 これは，高濃度添加により溶液中にグアニンが多く存在するためと思われる。 GMPのEICでは，2つの主要なピークが目立つものの，明確なピークを持たない広い領域が観察された。 また、EICの質量分布からグアニン化合物に関連する化学種は+のみ検出された。 MSデータからcGMPのEICを抽出し、質量分布で＋と＋の化学種を示すと、対になった4つのピークが観察された。 一方、グアノシンのEICは3本のピークを示し、その中で最も強いピークが質量分布に＋の存在を示した。

シトシンとグアニンのグリコシル化生成物の生成は、AMPグリコシド結合の開裂が我々の反応条件で起こったことを証明した。 AMP、cAMP、アデノシンのEICを分析すると、各クロマトグラムに複数のピークが観察され、脱水反応中にグリコシド結合がダイナミックに加水分解・形成されるという説が支持された34。 シトシンおよびグアニンヌクレオチドとアデニンとの反応についても検討した。 CMPとアデニンの脱水反応では、核酸塩基交換に相当する生成物は観察されなかった（補足図103-108/a）。 しかし、GMPとアデニンの反応では、アデニンの糖化生成物が明確に検出された（補足図105-108/b）。 これは、同じ反応条件下で、GMPのグリコシド結合の加水分解がCMPの場合よりも容易であるためである34。 また、アデニンの直接のピリミジンアナログと比較するために、UMPとアデニンとの核酸塩基交換反応も行った(Supplementary Fig. 109)。 その結果、GMPの収率よりも補足図108に示したCMPの収率に近く、UMP反応におけるアデニン糖鎖生成物の収率は非常に低く、AMPやcAMPを検出するには十分ではなかった。

糖鎖生成物の分布に対するアミノ酸の影響

前述のように、初期の地球にはアミノ酸、ヌクレオチドとその構成要素が同時に存在した可能性がある。 したがって、共重合反応の生成物、あるいは、ある種のポリマーが他のポリマーに対して何らかの触媒効果を発揮することによって生じる生成物が、プレバイオティクス環境下で発生した可能性がある。 ワンポット脱水反応におけるヌクレオチド構成分子とアミノ酸の共反応を調べるため、最も単純なアミノ酸であるグリシンをP-リボースとそれぞれの核酸塩基の脱水反応に加えたところ、P-リボースの脱水反応とアミノ酸の脱水反応が同時に進行することがわかった。 グリシンを取り込むと、グリコシル化生成物の生成に明確な影響を与え、AMP異性体、cAMP異性体、アデノシンの質量を持つ生成物の全体収率が減少した（図4a、補足図28-32）。 このことは、グリシンが副反応によってヌクレオチドのビルディングブロック（P-リボースやアデニン）を消費するか、あるいは生成物の構造に付着してその質量を変化させる役割を担っていることを示している。 これらの反応のEIC解析では、グリシン付加体（すなわち、AMP-Gly、cAMP-Gly、アデノシン-Gly、アデニン-Gly）の質量に相当するピークが検出されたが（補足図115-122）、これらの副産物は、観察された変化すべてを説明できるほど大量には生成していない。 また、重水素化グリシンを出発物質とし、P-リボース、アデニンと共に用いることで、付加体質量の同位体分布に変化が生じることを確認した（補足図123, 124）。 P-リボースとアデニンの反応によるグリコシル化生成物（AMP異性体、環状AMP異性体、アデノシン）の生成では、半定量的に最大59%の収率が得られたが、グリシンを反応液中に共存させた場合には46%しか得られなかった（Supplementary Fig.144）。 個々の異性体の収率をすべて定量することは技術的に困難であるが、一部の異性体の収率は純粋な標準物質を用いて半定量的に決定することができる。 アデノシン5′-一リン酸およびアデノシン2′，3′-環状一リン酸は、グリシンの非存在下でそれぞれ38.7％および18.2％であり、グリシンの存在下では、両方のアイソマーについて収率が著しく低下する（＜7203＞2％）ことが判明した

グリシン存在下および非存在下の糖化生成物。 a 25 mM P-リボースと25 mM アデニンの反応生成物は実線で、25 mM グリシン、25 mM P-リボース、25 mM アデニンの反応生成物は破線で示されている。 すべての反応は、出発物質を酸性水溶液中で90℃、指定時間加熱することによって行われ、その後、サンプルはRP-HPLC-MSによって分析された。 b アデノシン一リン酸のEIC（m/z = 348.0683 ± 0.c 環状グアノシン一リン酸のEIC (m/z = 346.0547 ± 0.01) 25 mMグアニン+25 mM P-リボースの反応を25 mMグリシンの存在下(赤)と非存在下(黒)で比較した。 各データポイントは3反復の平均値±標準偏差

グリシンは異性体の分布にも影響を与え、グリシン存在下と非存在下でP-リボースとアデニンの反応によるベースピーククロマトグラム（BPC）と比較して明確な違いが見られた（図4b、補足図110-114）。 これらのデータから、グリシンがある場合とない場合では、異なる化学種が存在し、その結果、質量分布が変化していることが示された。 次に、各アデニン糖鎖生成物について個別のEICを解析したところ、グリシンを加えたときのピークの相対強度に明確な違いが観察された。 これらの結果は、グリシンがどの異性体が優先的に生成されるかに選択的に作用していることを明確に示している。 グリシンは脱水条件下で他のアミンと容易に反応することが知られており12、核酸塩基の一級アミンと反応する可能性が高い。 グリシンを含むハイブリッド副産物（Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosine, Gly-Adenine）は収率1％程度で検出されるが（補足図145）、この小さな割合がアデニン糖鎖付加生成物の異性体分布に大きな影響を与える（補足図146、147を参照）。 重水素化グリシンを脱水反応に含めた場合、ハイブリッド生成物の質量の同位体分布に変化が見られ（補足図123、124）、ハイブリッド構造にグリシンが含まれることが確認された。

P-リボースをグリシン存在下でシトシン／グアニンと反応させた場合にも同様のアイソマー分布への効果が見られた（図4c、補足図125〜140）。 異なる異性体種（GMP, CMP, cGMP, cCMP, グアノシン、シチジン）の最大強度は減少し、相対強度の分布にも影響が見られた。 この実験間の差異を、EICデータのクラスター分析などの統計的手法を用いて厳密に検証し、グリシンの有無にかかわらず、試料を共通の特徴を持つ構成グループ／クラスターに区分した（図5）。 本研究におけるクラスター分析の目的は、データ（ヌクレオチドやヌクレオシドの構造形成）を、共通の特徴を持つ構成集合体（例えば、グリシン添加とグリシン無添加）にグループ化することである。 この解析では、クラスタ/グループ内の高い内部均一性とクラスタ/グループ間の高い外部異質性を示す必要があります。 図5は、「区」の連鎖を持つデンドログラムを表示している35。 デンドログラムでクラスタを識別するために、グリシンの有無によってスペクトルを色分けした（グリシン-赤、グリシンなし-黒、ブランク-青）。 見ての通り、グリシンを含むサンプルはクラスタリングされている。 1つのクラスターはP-リボース＋アデニン＋グリシン（3サンプル）に対応し、グリシンを含まないサンプルと分離している。 もう一つは、P-リボース＋グアニン＋グリシン、P-リボース＋シトシン＋グリシンに対応するクラスターである。 アデニンを含む試料は、他の試料と区別された大きなクラスターに分離し、反応にアデニンが強く影響していることがわかる。 実際、実施した反応条件下では、他にも多くの生成物や反応が考えられる（詳細は補注1および補図150〜162参照）

Dendrogram and base peak chromatograms (BPC)-Fig. クラスター分析により、試料を共通の特徴を持つ構成グループに束ねることができました。 デンドログラムでは、グリシン存在下と非存在下でそれぞれ3回ずつ反応を行い、クラスタ内で高い内部均一性を示しました。 同時に、この方法は、アデニン試料が他のヌクレオチドよりも離れた大きなクラスターを構成する、クラスター間の高い外部不均一性を示す

他のアミノ酸も、グリコシル化生成物のアイソマー分布に何らかの影響を与えるかどうかを調べるためにアデニンのPリボースとの脱水反応に含めた（補足図141〜143）。 この研究で選んだ6つのアミノ酸（アルギニン、グルタミン酸、スレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン）は、側鎖が異なり、化学的性質や官能基も異なっている。 P-リボースとアデニンのみの反応で得られたデータと比較すると、トリプトファンの場合を除き、すべての反応でAMPの異性体分布に変化が見られ、これはトリプトファンのインドール系側鎖の存在によるコンフォメーションの制限に起因すると思われた。 cAMP EICを分析したところ、異性体ピークの相対強度の変化はより小さいことがわかった。 しかし、フェニルアラニンとスレオニンを含む反応では、アデノシンのEICにのみ明確な違いが観察された

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