Sintesi integrata di nucleotidi e nucleosidi influenzati da aminoacidi

Formazione simultanea di prodotti di glicosilazione

La formazione di strutture nucleosidiche e nucleotidiche da precursori semplici è stata ottenuta contemporaneamente con tre nucleobasi mediante reazioni di disidratazione. Questo è in contrasto con il lavoro precedente in questo campo, dove le condizioni sono state ottimizzate per favorire prodotti specifici24,25,26. In un tipico esperimento di glicosilazione, adenina e P-ribosio sono stati riscaldati a 90 ° C per 5 h a pH 2,5. Abbiamo osservato la formazione di adenina monofosfato (AMP) nucleotide (e suoi isomeri) quando adenina e P-ribosio sono stati combinati. I cromatogrammi degli ioni estratti (EICs) ottenuti dall’analisi HPLC-MS dei prodotti hanno rivelato diversi picchi con m/z corrispondenti + e + (Figg. supplementari 13-15). Il confronto con gli standard ha confermato che l’AMP corrisponde al picco trovato a RT = 4,2 min (Figg. supplementari 5, 6); altri picchi principali potrebbero essere coerenti con gli isomeri di AMP, come l’isomero N6-ribosilato. Per confermare questo, una reazione di idrolisi in presenza di NaOH (0,1 M) è stata eseguita, nel tentativo di differenziare tra i diversi isomeri, considerando che l’isomero N6-ribosilato è più incline all’idrolisi. Tuttavia, si può osservare un leggero disturbo nei picchi, che rende difficile confermare l’identità dell’isomero N6-ribosilato. Abbiamo poi analizzato due standard puri di due diversi isomeri (adenosina 3′- monofosfato e adenosina 5′- monofosfato monoidrato) singolarmente e in una miscela al fine di chiarire il profilo di eluizione degli isomeri (Figg. 148, 149 supplementari). Uno spostamento del tempo di ritenzione può essere osservato per la miscela standard fornendo una migliore correlazione con l’eluizione di questi composti nel campione reale. Anche se è difficile differenziare tra isomeri, possiamo confermare la presenza di almeno due isomeri all’interno dei prodotti AMP confrontando il profilo di eluizione della miscela standard al campione reale. Ora è chiaro che la formazione di diversi isomeri (Fig. 12 supplementare) è una possibile ragione per l’eluizione di nucleotidi con le stesse masse a tempi di ritenzione diversi. Inoltre, MS / MS analisi dei nostri prodotti di reazione rivela frammentazione di AMP (e suoi isomeri) per adenina (m / z = 136.0617 ± 0,01) (Supplementary Fig. 20), questo è coerente con la frammentazione del canonico AMP standard. Il meccanismo di reazione da noi proposto consiste nella formazione di un legame glicosidico tra un gruppo 1′-OH di ribosio e un gruppo amminico di adenina (vedi Fig. 12 supplementare).

Le reazioni time-course mostrano che l’evaporazione dell’acqua è la principale forza motrice per la formazione di prodotti di glicosilazione, mostrando un aumento significativo nella formazione di strutture nucleosidiche e nucleotidiche nel periodo di tempo tra 2 e 4 h (Fig. 2a). Questo corrisponde all’intervallo di tempo in cui il volume del campione è drasticamente diminuito e i reagenti sono estremamente concentrati. Dopo 5-6 h di reazione, il campione raggiunge la secchezza e il tasso di reazione (seguito dall’intensità nelle misure HPLC-MS) si stabilizza. Oltre all’AMP, i prodotti contenenti legami glicosidici, compresi i nucleotidi ciclici (cioè il cAMP)27 e i nucleosidi (cioè l’adenosina), sono stati rilevati mediante RP-HPLC-MS, MS/MS, e testati per la formazione di 1,N6-eteno derivati28,29, confermati dal confronto con gli standard (Fig. 2, Figure supplementari 7-11, Figure supplementari 23-27). I tempi di ritenzione di 2′,3′-cAMP e 3′,5′-cAMP standard canonici non corrispondevano ai tempi di ritenzione dei picchi EIC nel campione. Tuttavia, le distribuzioni di massa (+; +) e modelli di frammentazione (+) erano identici (Figg. supplementari 16-21). Questi risultati dimostrano che mentre si formano strutture cicliche, il cAMP canonico non è il prodotto principale. Il confronto con uno standard analitico di adenosina mostra anche che l’adenosina, insieme ad un certo numero di specie isomeriche, si forma nella reazione di condensazione di P-ribosio e adenina (Figg. supplementari 18-22). Mentre le forme canoniche di AMP e adenosina sono state confermate in questi esperimenti, non erano i prodotti principali nella reazione di disidratazione.

Quando il fosfato è stato fornito separatamente come pirofosfato e ha reagito con adenina e ribosio, un composto con la massa di adenosina è stato rilevato e una bassa quantità di AMP e cAMP sono stati rilevati, e adenosina ancora formato quando nessuna fonte fosfato era presente (Supplementary Figs. 33-41). Vale la pena notare che abbiamo intenzionalmente focalizzato i nostri studi sull’identificazione dei prodotti fosforilati (isomeri AMP e isomeri cAMP) e prestato meno attenzione all’identificazione dei prodotti fosforilati che non sono isomeri AMP e isomeri cAMP30,31,32. Proponiamo la formazione di un legame glicosidico tra il gruppo idrossile del ribosio e un gruppo amminico dell’adenina, che viene innescato dalla perdita di una molecola d’acqua per evaporazione. La reattività relativa dei gruppi amminici primari e secondari dell’adenina è ben studiata33 e senza attivazione o presenza di un gruppo di protezione, il legame glicosidico all’ammina primaria è normalmente preferito. Pertanto, l’isomero canonico di adenosina/AMP non dovrebbe essere un prodotto principale, in quanto richiederebbe la reazione esclusivamente all’ammina secondaria. Tuttavia, la reattività è sufficientemente alta nel sito dell’ammina secondaria perché si formino gli isomeri canonici, anche se non come prodotto principale. In altre nucleobasi, come la guanina, ci sono ancora più gruppi amminici accessibili, e il potenziale per prodotti isomerici è maggiore. La reattività del ribosio è probabile che sia prevalentemente attraverso la posizione anomerica, portando a meno possibili isomeri, anche se alcuni altri prodotti minori possono essere osservati.

La reattività di altre nucleobasi canoniche (citosina, guanina e timina) con P-ribosio è stata anche studiata. Masse corrispondenti a strutture nucleosidiche e nucleotidiche sono state rilevate in seguito alla reazione di disidratazione di guanina e citosina con P-ribosio (Fig. 3 e Figg. supplementari 50-64). Le strutture di guanina glicosilazione si sono formate in misura relativamente bassa, probabilmente a causa della solubilità limitata della guanina a basso pH. Le quantità di prodotto misurate per la 5-metiluridina monofosfato (m5UMP) e la 5-metiluridina (nucleoside della timina) erano addirittura inferiori ai loro equivalenti da guanina e citosina (Fig. 3 e Figg. supplementari 65, 66). Questi risultati possono essere spiegati dalla presenza di un gruppo amminico primario nella guanina e nella citosina, che manca nella timina. Mentre tutte e tre le nucleobasi hanno gruppi amminici secondari, questi sono meno reattivi nella formazione di legami glicosidici. Quindi, la formazione di strutture nucleosidiche e nucleotidiche attraverso una reazione di ammina secondaria, come è richiesto per formare prodotti di glicosilazione canonici, è sfavorita nelle nucleobasi dove sono disponibili ammine primarie. Questo ha un’implicazione interessante per l’adozione della chimica degli acidi nucleici nell’origine della vita, in quanto suggerisce che i nucleotidi canonici potrebbero essere stati inizialmente inadatti fino a quando non fossero emersi ulteriori macchinari biochimici per aumentare la selettività verso gli isomeri corretti. Pertanto, come previsto, mentre i prodotti nucleotidici e nucleosidici canonici di citosina e guanina si sono formati nei nostri esperimenti, essi non corrispondono ai picchi principali osservati (Figg. 42-49 supplementari). Combinando queste due osservazioni (tempi di ritenzione diversi ma stessa distribuzione di massa degli standard canonici negli EIC), possiamo concludere che le specie nucleotidiche e nucleosidiche formate dalla reazione di disidratazione di guanina/citosina con P-ribosio erano principalmente specie isomeriche dei nucleotidi e nucleosidi canonici (alcune possibili strutture sono mostrate nelle Figg. 50, 51).

Tipicamente, la formazione di strutture nucleotidiche è stata eseguita in condizioni specifiche a seconda della nucleobase utilizzata, mirando ad uno specifico prodotto di reazione. In un approccio alternativo, abbiamo deciso di includere più nucleobasi simultaneamente nella reazione con il P-ribosio. Il nostro obiettivo era quello di determinare se la formazione di prodotti con più nucleobasi nelle stesse condizioni di reazione avrebbe prodotto una miscela di prodotti o sarebbe stata dominata da uno solo. Questa reazione è stata effettuata includendo due o tre nucleobasi (adenina, guanina e citosina) simultaneamente nel recipiente di reazione, insieme al P-ribosio. Si è ottenuta una miscela di prodotti di glicosilazione, comprendente nucleotidi (AMP, GMP e CMP) e i rispettivi nucleotidi ciclici (cAMP, cGMP e cCMP) e prodotti nucleosidici (adenosina, guanosina e citidina) (Figure supplementari 67-95). I prodotti di glicosilazione della guanina si sono formati con una resa inferiore rispetto a quelli dell’adenina e della citosina, come ci si aspettava a causa della bassa solubilità della guanina in condizioni acide.

Scambio di nucleobase

Lo scambio di nucleobase è stato osservato quando Na+AMP è stato riscaldato per 5 ore a 90 °C in mezzi acquosi acidi con citosina o guanina. Lo scambio di nucleobasi ha portato alla formazione di strutture nucleotidiche (CMP o GMP), nucleotidiche cicliche (cCMP o cGMP) e nucleosidiche (citidina o guanosina) (vedi figg. 96-102 supplementari e tabella 1 supplementare per le rese semi-quantitative). In questo esperimento, CMP e citidina hanno mostrato una tendenza all’aumento dell’intensità, mentre cCMP ha raggiunto un’intensità massima quando era 12,5 mM e poi è sceso fino a un’intensità di 4,0 × 104 AU (Supplementary Figs. 102a e 155-158). Ad una concentrazione di citosina di 37,5 mM, il composto con la maggiore intensità è risultato essere il CMP e le intensità misurate per il cCMP e la citidina erano quasi le stesse. Due specie isomeriche principali sono state osservate negli EIC di CMP e cCMP. Le masse +, + e + sono state rilevate nel caso di CMP, mentre cCMP ha mostrato +, + e + all’interno delle rispettive distribuzioni di massa. Nel caso della citidina, + era il principale picco rilevato. Queste distribuzioni di massa corrispondevano a quelle osservate negli standard. Tuttavia, il tempo di ritenzione degli isomeri principali non corrispondeva al CMP canonico e alla citidina. Quando l’AMP è stato fatto reagire con concentrazioni crescenti di guanina (Fig. 102b supplementare), tutti e tre i prodotti di glicosilazione (GMP, cGMP e guanosina) hanno raggiunto un valore massimo quando la concentrazione di guanina era 2,5 mM (Figg. 160-162 supplementare). Questi risultati erano la conseguenza della limitata solubilità della guanina a pH acido, quindi, anche se veniva aggiunta più guanina al recipiente di reazione, la concentrazione effettiva nella soluzione era la stessa. Dopo il valore massimo, l’intensità del cGMP e della guanosina erano costanti, a causa della scarsa solubilità della guanina. Solo un piccolo aumento dell’intensità di tutti e tre i prodotti di guanina glicosilazione è stato osservato quando = 37,5 mM, che potrebbe essere legato a una maggiore presenza di guanina nella soluzione a causa dell’alta concentrazione aggiunta. Nell’EIC del GMP, è stata osservata una vasta area senza picchi ben definiti, anche se due picchi principali si sono distinti. + era l’unica specie chimica, legata ai composti di guanina, rilevata nella distribuzione di massa sul suo EIC. Quattro picchi, raggruppati in coppie, sono stati osservati quando l’EIC del cGMP è stato estratto dai dati MS e la distribuzione di massa ha mostrato specie + e +. D’altra parte, l’EIC della guanosina ha presentato tre picchi, il più intenso dei quali ha mostrato la presenza di + nella sua distribuzione di massa.

La formazione di prodotti di glicosilazione di citosina e guanina ha dimostrato che la scissione del legame glicosidico dell’AMP è avvenuta nelle nostre condizioni di reazione. Quando gli EICs di AMP, cAMP e adenosina sono stati analizzati, diversi picchi sono stati osservati in ogni cromatogramma, sostenendo la teoria che i legami glicosidici subiscono idrolisi dinamica / formazione durante la reazione di disidratazione34. Sono state studiate anche le reazioni dei nucleotidi di citosina e guanina con l’adenina. Nel caso della reazione di disidratazione di CMP e adenina, nessun prodotto corrispondente allo scambio di nucleobase potrebbe essere osservato (Supplementary Figs. 103-108/a). Tuttavia, i prodotti di glicosilazione dell’adenina sono stati chiaramente rilevati nella reazione di GMP con l’adenina (Figure supplementari 105-108/b). Questo perché l’idrolisi dei legami glicosidici in GMP è più facile che per CMP, nelle stesse condizioni di reazione34. Abbiamo anche effettuato la reazione di scambio nucleobase con UMP e adenina, al fine di confrontare con l’analogo pirimidinico diretto dell’adenina (Fig. supplementare 109). I risultati sono stati più simili alle rese CMP mostrate nella Fig. Supplementare 108, che alle rese GMP, ottenendo una resa molto bassa per i prodotti di glicosilazione dell’adenina nella reazione UMP che non è sufficiente per consentire la rilevazione di AMP e cAMP.

Effetto degli aminoacidi sulla distribuzione dei prodotti di glicosilazione

Come già detto, gli aminoacidi, i nucleotidi e i loro elementi costitutivi potrebbero essere stati presenti contemporaneamente sulla Terra primitiva. Pertanto, i prodotti di una reazione di copolimerizzazione, o anche i prodotti risultanti da qualche effetto catalitico di un tipo di polimero sull’altro, potrebbero essersi verificati in un ambiente prebiotico. Per studiare la co-reattività dei nucleotidi e degli aminoacidi in una disidratazione one-pot, la glicina, l’aminoacido più semplice, è stata inclusa nelle reazioni di disidratazione del P-ribosio e delle rispettive nucleobasi. L’incorporazione della glicina ha avuto un chiaro effetto sulla formazione dei prodotti di glicosilazione, facendo diminuire la resa complessiva dei prodotti con la massa di isomeri AMP, isomeri cAMP e adenosina (Fig. 4a e Figure supplementari 28-32). Questo indica che la glicina gioca un ruolo nel consumare i blocchi di costruzione del nucleotide (P-ribosio e/o adenina) attraverso una reazione laterale, o che si attacca alla struttura del prodotto, cambiandone la massa. Analisi EIC per queste reazioni rivela picchi corrispondenti alla massa di addotti glicina (cioè AMP-Gly, cAMP-Gly, adenosina-Gly e adenina-Gly) (Supplementary Figs. 115-122), anche se questi prodotti collaterali non sono formati in quantità sufficiente per spiegare tutti i cambiamenti osservati. Gli addotti della glicina sono stati confermati anche utilizzando glicina deuterata come materiale di partenza insieme a P-ribosio e adenina, che ha causato cambiamenti nella distribuzione isotopica delle masse degli addotti (Figg. 123, 124 supplementari). Un massimo rendimento semi-quantitativo del 59% è stato ottenuto per la formazione di prodotti di glicosilazione (isomeri AMP, isomeri ciclici AMP e adenosina) nella reazione di P-ribosio e adenina; tuttavia, solo il 46% di rendimento è stato ottenuto quando la glicina era presente anche nel mezzo di reazione (Fig. supplementare 144). Quantificare i rendimenti per tutti i possibili isomeri individuali è tecnicamente difficile, ma i rendimenti semi-quantitativi di alcuni isomeri potrebbero essere determinati utilizzando standard puri: Adenosina 5′-monofosfato e adenosina 2′,3′-monofosfato ciclico sono stati trovati al 38,7% e 18,2%, rispettivamente, in assenza di glicina, mentre la resa in presenza di glicina è risultata essere significativamente abbassata (<2%) per entrambi gli isomeri.

La glicina ha anche influenzato la distribuzione delle specie isomeriche, e chiare differenze sono state osservate rispetto al cromatogramma del picco base (BPC) dalla reazione di P-ribosio e adenina, in presenza e assenza di glicina (Fig. 4b e Figg. Supplementari 110-114). Questi dati hanno indicato la presenza di diverse specie chimiche e un conseguente cambiamento nella distribuzione della massa tra le reazioni con e senza glicina. Singoli EICs sono stati poi analizzati per ogni prodotto di glicosilazione dell’adenina, con il risultato di chiare differenze osservate nelle intensità relative dei picchi quando la glicina è stata aggiunta. Questi risultati mostrano chiaramente che la glicina ha un effetto selettivo su quali specie isomeriche si formano preferenzialmente. La glicina è nota per reagire prontamente con altre ammine in condizioni disidratanti12, ed è probabile che reagisca con le ammine primarie di nucleobasi. Prodotti collaterali ibridi tra cui glicina (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosina, Gly-Adenina) sono stati rilevati in ~ 1% di rendimento (Supplementary Fig. 145), tuttavia, questa piccola percentuale ha un effetto importante sulla distribuzione isomerica dei prodotti glicosilazione adenina (vedi Figg. Supplementari 146, 147). Un cambiamento nella distribuzione isotopica delle masse dei prodotti ibridi è stato rilevato (Figg. Supplementari 123, 124) quando la glicina deuterata è stata inclusa nella reazione di disidratazione, confermando l’inclusione della glicina nelle strutture ibride.

Un effetto simile sulla distribuzione isomerica è stato osservato anche quando il P-ribosio è stato fatto reagire con citosina/guanina in presenza di glicina (Fig. 4c, Figg. Supplementari 125-140). Le intensità massime delle diverse specie di isomeri sono diminuite (GMP, CMP, cGMP, cCMP, guanosina e citidina), mentre anche la distribuzione delle intensità relative è stata influenzata. Le differenze tra gli esperimenti sono state rigorosamente verificate utilizzando un metodo statistico come la cluster analysis dei dati EIC per segmentare i campioni, in presenza e in assenza di glicina, in gruppi/cluster costituenti con caratteristiche comuni (Fig. 5). L’obiettivo della cluster analysis in questo studio è quello di raggruppare i dati (cioè la formazione della struttura nucleotidica e nucleosidica) in gruppi costituenti con caratteristiche comuni (ad esempio, l’aggiunta di glicina rispetto a nessuna glicina). Questa analisi dovrebbe dimostrare un’elevata omogeneità interna ai cluster/gruppi e un’elevata eterogeneità esterna tra i cluster/gruppi. La Fig. 5 mostra un dendrogramma con collegamento “Wards “35. Per identificare i cluster nel dendrogramma, abbiamo colorato gli spettri in base alla presenza di glicina (glicina – rosso, nessuna glicina – nero, vuoto – blu). Come si può osservare, i campioni contenenti glicina si raggruppano insieme. Un cluster corrisponde a P-ribosio + adenina + glicina (tre campioni), che è separato dai campioni senza glicina. Un secondo cluster corrisponde a P-ribosio + guanina + glicina e P-ribosio + citosina + glicina. I campioni contenenti adenina si separano in un cluster più grande che si distingue dagli altri campioni, indicando una forte influenza dell’adenina nella reazione. Infatti, ci sono una serie di altri possibili prodotti e reazioni che potrebbero avvenire nelle condizioni di reazione condotte (vedi Nota supplementare 1 e Figure supplementari 150-162 per maggiori dettagli).

Altri aminoacidi sono stati inclusi nella reazione di disidratazione dell’adenina con P-ribosio per verificare se anche loro avrebbero avuto qualche effetto sulla distribuzione isomerica dei prodotti della glicosilazione (Figg. 141-143 supplementari). I sei aminoacidi selezionati per questo studio (arginina, acido glutammico, treonina, metionina, fenilalanina e triptofano) hanno diverse catene laterali, con diverse nature chimiche e gruppi funzionali. Quando i risultati sono stati confrontati con i dati ottenuti dalla reazione di solo P-ribosio e adenina, sono stati osservati cambiamenti nella distribuzione isomerica di AMP in tutte le reazioni, tranne nel caso del triptofano, che potrebbe essere attribuito a limitazioni conformazionali dovute alla presenza della catena laterale indolica del triptofano. Analizzando gli EIC del cAMP, sono stati notati cambiamenti minori nell’intensità relativa dei picchi isomerici. Tuttavia, una chiara differenza è stata osservata nell’EIC dell’adenosina solo per le reazioni che includono fenilalanina e treonina.