MTT, un tetrazolo giallo, viene ridotto a formazan viola nelle cellule viventi. Una soluzione di solubilizzazione (di solito dimetilsolfossido, una soluzione di etanolo acidificato, o una soluzione del detergente sodio dodecil solfato in acido cloridrico diluito) viene aggiunta per dissolvere il prodotto formazan viola insolubile in una soluzione colorata. L’assorbanza di questa soluzione colorata può essere quantificata misurando ad una certa lunghezza d’onda (di solito tra 500 e 600 nm) con uno spettrofotometro. Il grado di assorbimento della luce dipende dal grado di concentrazione di formazan accumulato all’interno della cellula e sulla superficie cellulare. Maggiore è la concentrazione di formazan, più profondo è il colore viola e quindi maggiore è l’assorbanza.
XTT (2,3-bis-(2-metossi-4-nitro-5-solfofenil)-2H-tetrazolio-5-carbossanilide) è stato proposto per sostituire MTT, ottenendo una maggiore sensibilità e una gamma dinamica più elevata. Il colorante formazan formato è solubile in acqua, evitando una fase finale di solubilizzazione.
I sali di tetrazolio solubili in acqua sono alternative più recenti all’MTT: sono stati sviluppati introducendo cariche positive o negative e gruppi idrossi all’anello fenile del sale di tetrazolio, o meglio con gruppi sulfonati aggiunti direttamente o indirettamente all’anello fenile.
MTS (3-(4,5-dimetiltiazolo-2-ile)-5-(3-carbossimetossifenile)-2-(4-solfofenile)-2H-tetrazolio), in presenza di metosolfato di fenazina (PMS), produce un prodotto formazan che ha un massimo di assorbanza a 490 nm in soluzione fisiologica tamponata. Il test MTS è spesso descritto come un test MTT “one-step”, che offre la comodità di aggiungere il reagente direttamente alla coltura cellulare senza i passaggi intermittenti richiesti nel test MTT. Tuttavia, questa comodità rende il test MTS suscettibile di interferenze colormetriche, poiché i passaggi intermittenti nel test MTT rimuovono le tracce di composti colorati, mentre questi rimangono nella piastra di microtitolazione nel test MTS one-step. Sono necessarie precauzioni per assicurare l’accuratezza quando si usa questo test e ci sono forti argomenti per confermare i risultati MTS usando osservazioni qualitative al microscopio. (Questo, tuttavia, è prudente per tutti i saggi colormetrici.)
I WST (sali di tetrazolio solubili in acqua) sono una serie di altri coloranti solubili in acqua per i saggi MTT, sviluppati per dare diversi spettri di assorbimento dei formazani formati. Il WST-1 e in particolare il WST-8 (2-(2-metossi-4-nitrofenile)-3-(4-nitrofenile)-5-(2,4-disolfofenile)-2H-tetrazolio), sono vantaggiosi rispetto all’MTT in quanto vengono ridotti all’esterno delle cellule, combinati con il mediatore di elettroni PMS, e producono un formazan solubile in acqua. Infine, i saggi WST (1) possono essere letti direttamente (a differenza di MTT che ha bisogno di una fase di solubilizzazione), (2) danno un segnale più efficace di MTT, e (3) diminuiscono la tossicità per le cellule (a differenza di MTT permeabile alle cellule, e la sua formazan insolubile che si accumula all’interno delle cellule).