Una delle procedure più importanti in virologia è la misurazione del titolo virale – la concentrazione di virus in un campione. Un approccio ampiamente utilizzato per determinare la quantità di virus infettivi è il test della placca. Questa tecnica è stata sviluppata per la prima volta per calcolare i titoli degli stock di batteriofagi. Renato Dulbecco modificò questa procedura nel 1952 per l’uso in virologia animale, e da allora è stata usata per una determinazione affidabile dei titoli di molti virus diversi.
Per eseguire un test della placca, vengono preparate diluizioni di 10 volte di un ceppo di virus, e aliquote di 0,1 ml vengono inoculate su monostrati di cellule sensibili. Dopo un periodo di incubazione, per permettere al virus di attaccarsi alle cellule, i monostrati vengono coperti con un mezzo nutritivo contenente una sostanza, solitamente agar, che causa la formazione di un gel. Quando le piastre vengono incubate, le cellule originariamente infette rilasciano la progenie virale. La diffusione dei nuovi virus è limitata alle cellule vicine dal gel. Di conseguenza, ogni particella infettiva produce una zona circolare di cellule infette chiamata placca. Alla fine la placca diventa abbastanza grande da essere visibile a occhio nudo. I coloranti che colorano le cellule viventi sono spesso usati per migliorare il contrasto tra le cellule viventi e le placche. Solo i virus che causano danni visibili alle cellule possono essere valutati in questo modo. Un esempio di placche formate da poliovirus su un monostrato di cellule HeLa è mostrato a sinistra. In questa immagine, le cellule sono state colorate con violetto di cristallo, e le placche sono facilmente visibili dove le cellule sono state distrutte dall’infezione virale.
Il titolo di uno stock di virus può essere calcolato in unità formanti placche (PFU) per millilitro. Per determinare il titolo del virus, si contano le placche. Per minimizzare l’errore, vengono contate solo le piastre che contengono tra 10 e 100 placche, a seconda delle dimensioni della piastra di coltura cellulare utilizzata. I principi statistici impongono che quando si contano 100 placche, il titolo del campione varierà di più o meno il 10%. Ogni diluizione viene piastrata in duplicato per migliorare la precisione. Nell’esempio mostrato di seguito, ci sono 17 placche sulla piastra fatta dalla diluizione 10-6. Il titolo dello stock di virus è quindi 1,7 x 108 PFU/ml.
Prossimo considereremo come il test delle placche può essere usato per preparare stock di virus clonali, un passo che è essenziale per studiare la genetica virale.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Alcuni problemi di virologia animale studiati con la tecnica delle placche. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279
.