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Tra i mammiferi, l’autotomia sembra essersi evoluta più volte, ma è tassonomicamente scarsa. L’autotomia documentata è tipicamente limitata alla coda e si verifica attraverso la perdita della guaina della coda (falsa autotomia) o attraverso la rottura attraverso la vertebra (vera autotomia)2,5. Oltre all’autotomia della coda, un riferimento casuale è stato fatto alle specie di mammiferi con pelle debole o fragile, anche se se questi animali sono in grado di autotomia della pelle rimane sconosciuto. Così, abbiamo cercato di indagare le prove aneddotiche che due specie di topo spinoso africano (Acomys kempi e Acomys percivali) prontamente sparso porzioni della loro pelle come un comportamento di fuga predatore.

Per verificare l’ipotesi che A. kempi e A. percivali sono capaci di autotomia della pelle, abbiamo live-trapped individui su affioramenti rocciosi (kopjes) nel Kenya centrale. Oltre ai peli di guardia, le specie del genere Acomys si distinguono per la presenza di peli simili a spine sul dorso (Fig. 1a, b). La manipolazione di entrambe le specie sul campo ha confermato che il movimento vigoroso ha spesso portato alla lacerazione della pelle. Lo strappo ha portato a grandi ferite aperte o alla perdita di pelle che va da piccoli pezzi ad aree che si avvicinano al 60% della superficie dorsale totale (Fig. 1c). Oltre alla perdita del tegumento, entrambe le specie hanno esibito autotomia della guaina della coda come precedentemente riportato per altre specie Acomys e gli individui sono stati spesso catturati con code mancanti 2. Tra gli individui in cattività, abbiamo osservato gravi ferite della pelle a guarire rapidamente, e rapida ricrescita di peli spinosi totalmente oscurato la zona ferita (Fig. 1d, e). Gli individui catturati sul campo hanno mostrato una guarigione simile e, in alcuni casi, follicoli piliferi modellati in anagen (cioè in fase di crescita) che sembravano essersi rigenerati nelle aree ferite (Fig. 1f).

Per valutare come la pelle di Acomys si strappi così facilmente, ci siamo chiesti se le proprietà meccaniche della pelle di Acomys potrebbero essere alla base della sua debolezza osservata. Sulla base di esperimenti che indagano l’autotomia della pelle nei gechi3, la pelle debole (cioè la pelle che possiede proprietà strutturali uniformi che fallisce o si rompe sotto un carico indotto relativamente basso) può essere differenziata dalla pelle fragile (cioè la pelle che possiede specifiche caratterizzazioni morfologiche come un piano di frattura che permette il rilascio degli strati esterni). Per valutare la debolezza della pelle, abbiamo confrontato le proprietà meccaniche della pelle di Acomys e Mus. Durante il carico meccanico, la pelle Mus ha mostrato proprietà elastiche prima della rottura, mentre la pelle Acomys era fragile e ha iniziato a strapparsi poco dopo l’applicazione del carico (Fig. 2a). Abbiamo derivato le curve sforzo-deformazione dalla pelle dorsale per determinare la resistenza media alla trazione (σm) e abbiamo scoperto che la pelle Mus era 20 volte più forte della pelle Acomys (2.3 MPa ±0.19 e 0.11 MPa ±0.03) (Fig. 2a, b). Infine, calcolando la tenacità media (W), quasi 77 volte più energia era necessaria per rompere la pelle di Mus rispetto a quella di Acomys (Fig. 2b). Questi risultati dimostrano che le Acomys possiedono una pelle che si strappa (o si rompe) facilmente in risposta alla bassa tensione applicata e forniscono una base meccanica per la debolezza della loro pelle.

Per valutare se le proprietà strutturali della pelle di Acomys hanno contribuito alla sua debolezza meccanica, abbiamo esaminato le caratteristiche cellulari della pelle di A. percivali e abbiamo scoperto che era anatomicamente comparabile a quella di Mus e di altri roditori, anche se con follicoli piliferi molto più grandi (Fig. 2c, d). Non abbiamo trovato alcuna prova di un piano di frattura, che è il meccanismo di autonomia della pelle in gechi e skink3. Esaminando le fibre di elastina, che aumentano l’elasticità della pelle, abbiamo trovato che tutte e tre le specie possedevano una simile distribuzione e abbondanza di elastina nel derma e sotto il pannicolo carnosus (Fig. S1a-f). Abbiamo testato se i follicoli piliferi più grandi nella pelle di Acomys hanno ridotto l’area dermica totale occupata dal tessuto connettivo esaminando la proporzione di annessi (ad esempio follicoli e ghiandole associate) all’interno del derma e abbiamo scoperto che era maggiore in A. percivali (55,61% ±4,28) rispetto a M. musculus (43,65% ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (Fig. 2e, f). Questi risultati suggeriscono che anche se la struttura di base del tessuto della pelle Acomys è simile a Mus, lo spazio occupato dagli annessi nel derma riduce il contenuto assoluto di tessuto connettivo, contribuendo potenzialmente alla minore elasticità e alla minore resistenza alla trazione quando la pelle è posta sotto tensione6. La mancanza di un piano di frattura sottolinea questo risultato e sostiene una differenza strutturale intrinseca alla base della debolezza osservata della pelle Acomys.

Data la sua debolezza strutturale intrinseca e la propensione allo strappo, abbiamo valutato la capacità di Acomys di guarire le ferite della pelle utilizzando piccole (4mm) e grandi (1.5cm), ferite escissionali a tutto spessore (FTE). Nelle ferite di entrambe le dimensioni la formazione della crosta e l’emostasi sono state rapide e, nelle ferite grandi, hanno contribuito a una riduzione del 64% ±3,1 dell’area della ferita 24 ore dopo la lesione (Fig. S2a). Durante la guarigione senza cicatrici nelle salamandre terrestri7 e nei feti di mammiferi8, il letto della ferita viene riepitelizzato entro diversi giorni, mentre una ferita di 4 mm nella pelle di ratto adulto richiede tra 5-7 giorni per riepitelizzare9. In Acomys, abbiamo trovato che cinque delle sei ferite da 4 mm avevano completamente riepitelizzato entro il giorno 3 post lesione (D3), mentre le ferite Mus non è riuscito a riepitelizzare questo rapidamente (Fig. 2g, h). Dopo la riepitelizzazione, mammiferi a pelle sciolta (ad esempio roditori, conigli, ecc) si basano principalmente sulla contrazione per guarire le loro ferite 10. Allo stesso modo, abbiamo osservato alti tassi di contrazione, che rappresentavano il 95% della chiusura della ferita dopo 17 giorni (Fig. S2a-c). In contrasto con la cicatrizzazione, dove le fibre di collagene si organizzano in una fitta rete parallela all’epidermide, durante la guarigione senza cicatrici le fibre di collagene assumono un modello simile al derma non ferito10. Esaminando la matrice extracellulare (ECM) a D10, abbiamo osservato la cicatrizzazione in Mus mentre in Acomys, le fibrille di collagene erano meno densamente imballati e conteneva una struttura più porosa (Fig. 2i, j). Usando il rosso picrosirius abbiamo trovato che il collagene di tipo I predominava il letto della ferita a D10 in Mus, mentre il collagene di tipo III era in maggiore abbondanza in Acomys (Fig. 2k, l). Questa differenza era ancora più pronunciata nelle ferite di 1,5 cm (Fig. S3a-b’). Insieme, questi dati dimostrano che la rapida riepitelizzazione e la contrazione del bordo della ferita riducono notevolmente la dimensione delle lacerazioni cutanee aperte in Acomys. I nostri risultati, che l’ECM della ferita (1) si deposita lentamente, (2) ha una configurazione porosa, e (3) è dominata dal collagene di tipo III, suggeriscono che questa composizione favorisce la rigenerazione rispetto alla fibrosi durante la riparazione della pelle in Acomys.

Per verificare la capacità rigenerativa dell’ambiente della ferita abbiamo campionato grandi ferite in via di guarigione per prove di neogenesi del follicolo pilifero e rigenerazione dermica. In associazione con l’ECM più poroso, abbiamo osservato la neogenesi follicolare dei normali peli pelvici e dei grandi peli spinosi nel letto della ferita tra D21 e D28 e abbiamo potuto distinguere i vecchi, grandi follicoli vicino ai margini della ferita dai follicoli appena rigenerati nel letto della ferita (Fig. 3a-d e Fig. S3c-e). I nuovi follicoli sembravano rigenerarsi in tutta la porzione non contratta del letto della ferita, non solo nella regione centrale (Fig. 3c e Fig. S3e) e abbiamo osservato follicoli rigenerati in varie fasi di sviluppo (Fig. 3a-m e Fig. S4a-c). Una popolazione localizzata e altamente proliferativa di cellule epidermiche guida lo sviluppo del follicolo pilifero e abbiamo osservato un fenomeno simile durante la rigenerazione del follicolo (Fig. 3e e Fig. S4a-c). Per indagare se le reti di segnalazione embrionali utilizzati durante lo sviluppo del follicolo pilifero sono stati distribuiti durante la rigenerazione del follicolo pilifero, abbiamo esaminato Keratin-17 (Krt17), che è diffusamente espresso all’interno dell’epidermide durante lo sviluppo della pelle e diventa progressivamente limitato a sviluppare follicoli piliferi 11. Dopo ri-epitelizzazione, KRT17 era altamente arricchito in tutta la neoepidermide sovrastante il letto della ferita a D14 e come nuovi follicoli piliferi formati nel letto della ferita, KRT17 divenne limitato a epitelio follicolare (Fig. 3f e Fig. S5). Durante la riparazione della ferita in Mus, abbiamo trovato KRT17 era anche altamente upregolato nell’epidermide riepitelizzata a D14 (Fig. S5) e anche se KRT17 localizzato ad alcuni cheratinociti basali nell’epidermide Mus a D21, questi siti non è riuscito ad aggregare in placodi o nuovi follicoli piliferi in modo che KRT17 era completamente assente dalla nuova epidermide da D26 (Fig. 3f). La scomparsa di KRT17 da cheratinociti basali in Mus, insieme con la nostra osservazione di localizzazione continua in nuovi placodi e follicoli piliferi in Acomys, suggerisce i segnali dermici sottostanti necessari per indurre la formazione di placode in Mus mancano.

Anche se il segnale preciso per la formazione del placode rimane oscuro, c’è un requisito assoluto per Wnt-segnalazione durante la normale formazione del follicolo12. La localizzazione nucleare della proteina LEF1 è stata usata come una lettura di questa segnalazione induttiva13. Abbiamo rilevato accumulo nucleare di LEF1 in rigenerazione placodi epidermici, condensazione fibroblasti dermici sotto il germe di capelli, e in papilla dermica e cellule della matrice (Fig. 3g, h e Fig. S6a). Abbiamo anche rilevato LEF1 nucleare colorazione a bassi livelli in alcuni non-placode cheratinociti basali, mentre non abbiamo rilevato LEF1 nucleare nell’epidermide durante la guarigione della ferita in Mus, suggerendo epidermica Wnt-attivazione in Acomys può parzialmente sotto la nostra osservazione di rigenerazione follicolo pilifero (Fig. S6b, c).

La regolazione della segnalazione canonica Bmp gioca anche un ruolo durante l’induzione del follicolo pilifero e la differenziazione delle popolazioni di progenitori follicolari nel follicolo pilifero maturo (recensione in14). La fosforilazione di SMADs 1, 5 e 8 (pSMAD1/5/8) è una robusta lettura della segnalazione Bmp canonica. Abbiamo rilevato pSMAD1/5/8 a bassi livelli durante l’induzione del follicolo e poi a livelli più elevati in papilla dermica e cellule della matrice in fase di differenziazione nel bulbo pilifero (Fig. 3i, j). Inoltre, abbiamo rilevato SOX2 positivo papilla dermica in alcuni follicoli piliferi rigeneranti, che è coerente con il suo ruolo nella specificazione di vari tipi di capelli durante lo sviluppo del follicolo pilifero del mouse 15 (Fig. 3k). Presi insieme, questi risultati dimostrano che i follicoli piliferi rigeneranti in Acomys progresso attraverso fasi definite di sviluppo del follicolo pilifero, mostrano alti tassi di proliferazione, e ri-impiegare percorsi molecolari utilizzati durante lo sviluppo embrionale follicolo pilifero per rigenerare nuovi follicoli piliferi.

Pelle dei mammiferi adulti è normalmente in grado di rigenerare epidermicamente derivato strutture in risposta alla ferita (ad esempio ghiandole e follicoli piliferi). Un’eccezione è l’osservazione della genesi follicolare spontanea in grandi ferite escissionali nei conigli, e più recentemente nei topi da laboratorio (C57BL6/SJ, SJL o ceppo misto)16,17,18. I conigli sono anche una delle poche specie di mammiferi in grado di rigenerare grandi ferite da perforazione dell’orecchio19. Abbiamo ipotizzato che la capacità rigenerativa osservata in Acomys potrebbe estendersi al loro tessuto dell’orecchio pure. Per testare questo abbiamo fatto pugni 4mm attraverso le orecchie di entrambe le specie Acomys e, con nostra sorpresa, abbiamo scoperto che erano in grado di chiudere questi grandi pugni (Fig. 4a-c e Fig. S7a-c). Il tessuto dell’orecchio non ferito contiene pelle (epidermide e derma), follicoli piliferi associati, cellule adipose, muscolo e cartilagine; abbiamo scoperto che le Acomys erano in grado di rigenerare completamente tutti questi tessuti con alta fedeltà tranne il muscolo (Fig. 4b-c). Dodici giorni dopo la ferita abbiamo osservato un accumulo di cellule intorno alla circonferenza della ferita sotto l’epidermide e anche se la rigenerazione di nuovi tessuti era centripeta, le cellule si accumulavano in misura maggiore sul lato prossimale del punzone. La rigenerazione del follicolo pilifero e della cartilagine procedeva in un’onda da prossimale a distale (Fig. 4d, e) e simile alla pelle, l’epidermide follicolare nell’orecchio attivava la segnalazione di Wnt (Fig. S6d, e). In contrasto con Acomys, abbiamo trovato Mus erano incapaci di rigenerare i pugni dell’orecchio 4mm e invece formavano tessuto cicatriziale (Fig. S8a, b). È interessante notare che, nonostante la formazione di cicatrici, la riparazione dell’orecchio Mus ha portato alla formazione de novo di condensazioni di cartilagine distale alla cartilagine tagliata suggerendo Mus potrebbe iniziare, ma non mantenere, una risposta rigenerativa dopo la ferita dell’orecchio (Fig, S8b).

Non è ancora chiaro se la rigenerazione dei mammiferi procede attraverso la formazione di un blastema, o è invece una versione esagerata della crescita iperplastica20,21,22. La formazione di blastema è considerata un segno distintivo della rigenerazione epimorfica. Una caratteristica di un blastema di rigenerazione è che contiene cellule proliferanti e mantiene la proliferazione durante la rigenerazione23. Abbiamo osservato proliferazione diffusa in tutto l’orecchio rigenerato in Acomys e sorprendentemente, in tutto il tessuto dell’orecchio guarigione in Mus (Fig. 4f, g). Tuttavia, abbiamo notato una mancanza di proliferazione nell’epidermide distale di Acomys, mentre abbiamo rilevato la proliferazione in tutta l’epidermide Mus che si estende alla punta distale (Fig. 4f, g). Mentre la proliferazione è stata mantenuta nelle orecchie Acomys, abbiamo osservato quasi senza cellule proliferanti in più tardi stadi Mus orecchie (Fig. 4h, i).

Una seconda caratteristica di un blastema è la formazione di un centro di segnalazione epidermica specializzata (l’epidermide ferita) che è necessario per le cellule proliferanti blastemal di rimanere nel ciclo cellulare24 ed è caratterizzata da una perdita di stratificazione epidermica, perdita di polarità cheratinocyte basale, e la mancanza di una lamina basale matura 25. Dopo riepitelizzazione in Acomys, abbiamo notato un ispessimento dell’epidermide distale, disorganizzazione dei cheratinociti basali, e l’assenza di una membrana basale matura (Fig. 4j). Comparativamente, l’epidermide vicino al piano di amputazione mostrava una stratificazione normale e possedeva una membrana basale prominente (Fig. 4k). Al contrario, Mus sembrava formare un’epidermide ferita solo transitoriamente dopo riepitelizzazione, con una zona distale proporzionalmente più piccola che espone queste caratteristiche per un breve periodo (dati non mostrati). Da D12 in Mus, il collagene di tipo IV colorazione ha rivelato una membrana basale matura sotto l’intera epidermide dell’orecchio di guarigione (Fig. 4l). Inoltre, l’epidermide esibito stratificazione normale e corretta polarità apicale-basale dei cheratinociti basali (Fig. 4g, l).

Oltre alla proliferazione sostenuta e la formazione dell’epidermide ferita, matrice extracellulare (ECM) molecole svolge un ruolo chiave nel sostenere la proliferazione e dirigere la differenziazione successiva durante la rigenerazione26. Al contrario, molecole come la laminina e il collagene di tipo I, che favoriscono la differenziazione, sono downregolate nel blastema durante la rigenerazione degli arti degli anfibi e sono espresse quando la differenziazione del sistema muscoloscheletrico procede26,27. L’esame istologico delle orecchie Acomys a D12 ha rivelato alti livelli di fibronectina (FN), alcuni tenascin-C (TN-C) che circondano le cellule densamente imballati, ma livelli molto bassi di collagene di tipo I (Fig. S9a-c). Il collagene di tipo III era anche più abbondante del collagene di tipo I durante la rigenerazione (Fig. S9d-d’). TN-C è diventato limitato dalle aree in cui la nuova cartilagine ha iniziato a differenziarsi e all’interno di queste cellule differenzianti abbiamo trovato l’attivazione della via di segnalazione Bmp nelle cellule che danno origine a nuova cartilagine auricolare (Fig. 4o e Fig. S10). Durante la crescita iperplastica nelle orecchie Mus, l’ECM inizialmente visualizzato alti livelli di FN e bassi livelli di TN-C come ha fatto orecchie Acomys, ma prodotto livelli relativamente più elevati di collagene di tipo I (Fig. S9e-g). La produzione di collagene in Mus non era solo più veloce e più abbondante, ma mostrava anche un più alto rapporto di collagene di tipo I a III (Fig. S9h, h’). Data la produzione esuberante di collagene di tipo I in Mus, abbiamo chiesto se i fibroblasti residenti si stavano differenziando in miofibroblasti, che contribuiscono alla cicatrizzazione al posto della rigenerazione (rivisto in 28). Utilizzando alfa actina muscolare liscia (αSMA), abbiamo trovato miofibroblasti in alta abbondanza in tutto il tessuto dell’orecchio in Mus, mentre erano quasi completamente assenti nelle orecchie Acomys (Fig. 4m, n). Questi dati confermano l’importanza della ferita ECM per promuovere la proliferazione mentre antagonizzare la differenziazione e sostenere il lavoro precedente che mostra precoce formazione di collagene di tipo I antagonizza la rigenerazione appendice27.

I nostri dati suggeriscono che la rigenerazione orecchio riparativa in Acomys è un equilibrio tra prematura riformazione del derma (cicatrici) e il mantenimento della proliferazione cellulare all’interno di un ambiente pro-rigenerativo. Al contrario, Mus non riesce a formare (o mantenere) un’epidermide ferita, che coincide con la formazione precoce della membrana basale e la stratificazione dell’epidermide. Questo porta alla perdita di proliferazione cellulare, all’aumento del deposito di collagene di tipo I (al posto del collagene di tipo III), all’attivazione dei miofibroblasti e infine alla formazione della cicatrice. Mentre i nostri dati suggeriscono che la rigenerazione dell’orecchio condivide caratteristiche simili alla formazione del blastema, la comprensione dei segnali molecolari necessari per organizzare e mantenere un’epidermide ferita e l’identificazione del lignaggio delle cellule rigeneranti è fondamentale per affrontare come la rigenerazione si verifica in questi animali. Il lavoro futuro che indaga su come le Acomys sono in grado di controllare la fibrosi farà luce su come la rigenerazione e la cicatrizzazione possono essere bilanciate di fronte all’infezione e all’infiammazione nei mammiferi selvatici e fornisce un sistema modello ideale in cui esaminare la rigenerazione epimorfica nei mammiferi.