GFP
La proteina fluorescente verde (GFP) è un singolo prodotto genico polipeptidico di 238 aminoacidi scoperto nella medusa Aequorea victoria. La proteina ha una fluorescenza verde naturale in specifiche condizioni di illuminazione. La proteina deriva la sua bioluminescenza dalla ciclizzazione Ser-Tyr-Gly nella sua sequenza aminoacidica primaria. GFP è abbastanza stabile e resiste a numerosi trattamenti e procedure chimiche.1 La prima dimostrazione che questa proteina fluorescente poteva essere espressa in un sistema eterologo fu in C. elegans.2 GFP è diventata da allora un gene reporter di scelta perché non richiede alcuna trasformazione biochimica, agente di contrasto o l’uso di radiazioni ionizzanti dannose per essere visualizzata.3 Da quel rapporto iniziale, l’espressione del gene reporter GFP è stata riportata in più organismi, compresi i topi.4 Inoltre, sotto la direzione di un promotore specifico, i topi transgenici GFP possono esprimere la proteina fluorescente in un tessuto e persino in un modo specifico della cellula. La visualizzazione non invasiva è la chiave per poter monitorare processi fisiologici e biochimici in vivo e in tempo reale.5
Ci sono numerosi modi per visualizzare la bioluminescenza della GFP. Un modo per rilevare la fluorescenza è con una luce UV portatile (365 nM). Ci sono diversi modelli offerti da Fisher in una gamma di prezzo di circa $100 a $200. Il metodo della luce UV portatile non funziona molto bene per il ceppo transgenico GFPX (Stock 003116). Il Dr. Andras Nagy, ricercatore donatore dei transgenici GFPX e GFPU (Stock 003115 e 003116), descrive una cuffia con visore e un filtro adattabile al microscopio che sono ora disponibili in commercio.
CFP e YFP
I recenti progressi hanno migliorato le caratteristiche e l’utilità di GFP come gene reporter. La GFP potenziata (EGFP) è stata ingegnerizzata per essere espressa a livelli più alti nelle cellule di mammifero e per diventare fluorescente più intensamente. La proteina fluorescente ciano (CFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP) sono varianti spettrali di GFP che permettono di marcare simultaneamente più tipi di cellule.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Comprendere, migliorare e utilizzare le proteine fluorescenti verdi. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Proteina fluorescente verde come marcatore di espressione genica. Scienza 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Imaging della proteina fluorescente verde delle cellule tumorali nei topi. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. ‘Topi verdi’ come fonte di cellule verdi ubiquitarie. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Whole-body imaging ottico di tumori e metastasi che esprimono proteina fluorescente verde. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
L’uso di un gene reporter può consentire l’esame dei modelli spaziali di espressione genica di un particolare promotore all’interno di un tessuto, embrione o topo adulto.1 Il gene lacZ dell’E. coli, quando integrato nel genoma del topo mediante tecniche transgeniche, può essere usato come gene reporter sotto il controllo di un determinato promotore/enhancer in una cassetta di espressione transgene. Il gene lacZ codifica la beta-galattosidasi, che catalizza la scissione del lattosio per formare galattosio e glucosio. L’attività della beta-galattosidasi può essere identificata sia con tecniche in situ che in vitro quando viene incubata con il substrato della beta-galattosidasi X-gal. La beta-galattosidasi scinde l’X-gal, un substrato cromogenico, producendo un colorante blu insolubile, permettendo così l’identificazione delle cellule con attività lacZ.2 Gli animali transgenici possono quindi essere usati per identificare i fattori e le condizioni che modulano il profilo di espressione del promotore o del potenziatore.