Ingegneria metabolica di Escherichia coli per la produzione di cinnamaldeide

Selezione di enzimi per la biosintesi della cinnamaldeide

La cinnamaldeide può essere sintetizzata dalla l-fenilalanina e la sua biosintesi richiede tre reazioni enzimatiche: (i) deaminazione della l-fenilalanina in acido cinnamico da parte della fenilalanina-ammoniaca liasi (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) legatura acido-tiolo dell’acido cinnamico a cinnamoil-CoA da parte della 4-cumarato:CoA ligasi (4CL, EC 6.2.1.12), e (iii) riduzione del cinnamoyl-CoA a cinnamaldeide da parte della cinnamoyl-CoA reduttasi (CCR, EC 1.2.1.44) (Fig. 1a) . PAL è un enzima ubiquitario che può essere trovato in molte piante, funghi e alcuni batteri, e ospita diverse attività e specificità a seconda dell’origine dell’enzima. Abbiamo esaminato due enzimi PAL, uno dalla pianta Arabidopsis thaliana (AtPAL) e un altro dal batterio Streptomyces maritimus (SmPAL), per la loro idoneità a produrre acido cinnamico in E. coli. Nel caso di AtPAL, ci sono quattro isomeri tra cui AtPAL1 a AtPAL4, ed è stato precedentemente segnalato che la maggior parte di loro (AtPAL1, 2, e 4) hanno attività similmente più elevate di quella di AtPAL3 a l-fenilalanina come substrato, quindi abbiamo selezionato AtPAL1 come rappresentante da fonte vegetale. Le loro costanti cinetiche (Km) sono state riportate come 68 e 23 μM, rispettivamente. Ogni enzima PAL legato a His è stato prodotto in E. coli BL21(DE3) e purificato seguendo le procedure descritte in “Metodi”. Entrambi gli enzimi, AtPAL1 (78 kDa) e SmPAL (56 kDa), sono stati purificati con successo (Additional file 1: Figura S1). Anche se il livello di espressione di AtPAL1 non era così alto che la banda non poteva essere visto nelle corsie 1 e 2 di SDS-PAGE, la banda di AtPAL1 potrebbe essere chiaramente visto dopo la cromatografia di affinità colonna nella corsia 3 in cui è stato caricato l’eluito concentrato. La molarità equivalente di ogni enzima PAL purificato è stata incubata con la stessa quantità di l-fenilalanina (come substrato), e il titolo di produzione di acido cinnamico è stato quantificato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (Additional file 2: Figura S2). Come mostrato in Fig. 1b, SmPAL ha esibito un’attività significativamente maggiore (21 volte alla reazione a 30 °C e 27 volte alla reazione a 37 °C) rispetto a quelle di AtPAL1.

Abbiamo anche esaminato due diversi enzimi 4CL, uno da Streptomyces coelicolor (ScCCL) e un altro da A. thaliana (At4CL), per la loro idoneità a convertire l’acido cinnamico in cinnamaldeide in E. coli. Nel caso di At4CL, è noto che ci sono 14 isoforme putative (At4CL1-At4CL14). Tra le 14 isoforme, At4CL1-3 hanno attività simili al cinnamato mentre il resto delle isoforme no. Pertanto, abbiamo selezionato At4CL1 come rappresentante. Inoltre, abbiamo usato l’enzima CCR di A. thaliana (AtCCR1) per la conversione del cinnamil-CoA in cinnamaldeide. Ogni enzima 4CL (At4CL1 e ScCCL ) è stato testato in combinazione con l’enzima CCR da A. thaliana (AtCCR). Tutti gli enzimi sono stati purificati con successo e con elevata purezza (file aggiuntivo 1: Figura S1). Per confrontare le attività enzimatiche di At4CL1 e ScCCL, due reazioni, (i) At4CL1 con AtCCR e (ii) ScCCL con AtCCR, sono stati preparati e mescolati con acido cinnamico come substrato. Dopo l’incubazione a 30 e 37 °C, il titolo di cinnamaldeide è stato analizzato mediante HPLC. Come mostrato in Fig. 1c, la combinazione di ScCCL e AtCCR ha portato ad un titolo di produzione superiore di cinnamaldeide (4,4 volte a 30 ° C reazione e 10,4 volte a 37 ° C reazione) rispetto alla combinazione di At4CL1 e AtCCR. Sulla base di questi risultati, abbiamo costruito il sistema di biosintesi della cinnamaldeide in E. coli come descritto di seguito utilizzando i seguenti enzimi: SmPAL, ScCCL e AtCCR.

Costruzione della via di biosintesi della cinnamaldeide in E. coli

Per produrre cinnamaldeide in E. coli, i geni SmPAL, ScCCL e AtCCR sono stati clonati in pTrc99A nel seguente ordine: SmPAL, ScCCL e AtCCR (ottenendo pHB-CAD) (Fig. 2a). E. coli W3110 che ospita pHB-CAD è stata coltivata a due diverse temperature (30 e 37 °C) per trovare la temperatura ottimale per la produzione di cinnamaldeide. L’espressione degli enzimi è stata analizzata mediante SDS-PAGE, seguita da analisi western blot come descritto in “Metodi”. Ad entrambe le temperature, tutti gli enzimi sono stati espressi bene e altamente solubili (Fig. 2b). Anche se ogni enzima era espresso a un livello diverso, l’espressione di ogni enzima era marginalmente migliore a 37 °C che a 30 °C. Inoltre, l’analisi del titolo di cinnamaldeide prodotta nel terreno di coltura utilizzando HPLC ha rivelato che il titolo di produzione di cinnamaldeide era 4,5 volte più alto a 37 °C che a 30 °C (Fig. 2c). Abbiamo supposto che il titolo di produzione più alto di cinnamaldeide a 37 °C era causato da un aumento del livello di espressione di tutti gli enzimi biosintetici a 37 °C attivamente, anche se questi enzimi sono attivi a 30 °C. In seguito, tutte le coltivazioni per la produzione di cinnamaldeide sono state eseguite a 37 °C.

Ingegneria della varietà per aumentare il pool intracellulare di l-fenilalanina

Per la biosintesi della cinnamaldeide, la l-fenilalanina è richiesta come precursore essenziale. Pertanto, per migliorare la produzione di cinnamaldeide, è auspicabile aumentare il pool intracellulare di l-fenilalanina. A questo scopo, abbiamo razionalmente ri-progettato E. coli per produrre l-fenilalanina più. Usando le informazioni metaboliche e normative disponibili come guida, abbiamo ingegnerizzato E. coli W3110 come segue: (i) delezione del gene crr che codifica la proteina EIIAGlc legata al sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasi (PTS) specifico del glucosio per moderare il tasso di assorbimento del substrato, diminuire l’eccesso di metaboliti e l’arricchimento dei precursori, (ii) delezione del gene tyrR per alleviare la stretta regolazione del regulon TyrR che contiene geni di sintesi degli aminoacidi aromatici (AAA), (iii) la delezione dei geni trpE (componente antrailato sintasi) e tyrA per prevenire la perdita del flusso di carbonio in vie concorrenti (biosintesi di l-triptofano e l-tirosina), e (iv) la delezione del gene pykA (piruvato chinasi A) per arricchire il precursore ed equilibrare il flusso tra crescita e produzione di l-fenilalanina (Fig. 3). Sulla base dello schema di cui sopra, sono stati sviluppati cinque mutanti knockout sequenziali di E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (Tabella 1).

In primo luogo, un fosfoenolpiruvato PTS specifico per il glucosio è stato inattivato per delezione del gene crr in E. coli W3110, ottenendo E. coli YHP01. Anche se questo interrompe il sistema principale per l’internalizzazione del glucosio, YHP01 può ancora crescere in mezzi definiti contenenti glucosio come unica fonte di carbonio perché il PTS mannosio-specifico e la galattosio permeasi possono continuare a internalizzare il glucosio nel citoplasma. Bypassando i risultati PTS in un pool aumentato di fosfoenolpiruvato (PEP), che in definitiva facilita la sintesi di l-fenilalanina. Successivamente, abbiamo eliminato il gene tyrR in YHP01 per produrre il ceppo YHP02. La proteina TyrR è un regolatore del regolatore TyrR, che contiene otto geni coinvolti nella biosintesi di AAA. La sua delezione può anche aumentare il pool di l-fenilalanina alleviando la stretta regolazione dei geni legati alla sintesi di AAA. Abbiamo poi eliminato sequenzialmente i geni trpE e tyrA a partire dal ceppo YHP02, ottenendo rispettivamente i ceppi YHP03 e YHP04. Nella via di biosintesi degli AAA, si verifica un punto di diramazione finale in cui il corismato può essere convertito in l-fenilalanina, l-triptofano o l-tirosina dagli enzimi PheA, TrpE o TyrA, rispettivamente. Le delezioni dei geni trpE e tyrA possono prevenire la perdita di carbonio in vie concorrenti per la biosintesi di l-triptofano e l-tirosina. Infine, abbiamo eliminato il gene pykA in YHP04 per produrre il ceppo YHP05. Il gene pykA codifica la piruvato chinasi A (PykA), che costituisce il secondo passo di consumo di PEP. Eliminando il gene pykA, più PEP può essere utilizzato nel percorso shikimate e di conseguenza, più quantità di l-fenilalanina può essere prodotta. In ogni ceppo (YHP01-YHP05), l’eliminazione dei geni è stata verificata mediante PCR ed elettroforesi su gel di agarosio (Additional file 3: Figura S3).

Tutti i ceppi di E. coli ingegnerizzati, compresi YHP01-YHP05 e l’E. coli parentale W3110, sono stati coltivati in fiasche di agitazione contenenti mezzi semi-definiti, e la crescita cellulare e la produzione di l-fenilalanina sono state confrontate. Dopo la coltivazione per 48 ore, tutti i ceppi ingegnerizzati sono cresciuti leggermente meglio del ceppo W3110; in particolare, il ceppo E. coli YHP05 ha mostrato la più alta densità cellulare (Fig. 4a). Uno studio precedente ha anche osservato che l’inattivazione degli isozimi PTS e Pyk ha aumentato il flusso di carbonio per la formazione della biomassa a causa dell’effetto di conservare quantità ridotte di metaboliti intermedi derivanti dalla diminuzione dell’assorbimento e del catabolismo del glucosio. Abbiamo anche analizzato il titolo di produzione di l-fenilalanina nel surnatante della cultura tramite HPLC. Nel ceppo parentale W3110, il titolo di produzione di l-fenilalanina era 0,24 g/L, ma il titolo di l-fenilalanina è stato gradualmente aumentato nei ceppi di E. coli ingegnerizzati (Fig. 4a). E. coli YHP05, in cui sono stati eliminati i geni crr, tyrR, trpE, tyrA e pykA, ha mostrato il più alto titolo di produzione di l-fenilalanina (0,52 g/L), che era 2,2 volte superiore a quello di E. coli W3110. coli (da YHP01 a YHP05) e l’E. coli parentale W3110 sono stati coltivati e sono stati confrontati la crescita cellulare (OD600) e i titoli di produzione di l-fenilalanina. b Il ceppo E. coli YHP05 che ospita diversi plasmidi (serie pTac15kG o pYHP) è stato coltivato e sono stati confrontati la crescita cellulare (OD600) e i titoli di produzione di l-fenilalanina. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media (n = 3)

Sistema di sovraespressione basato su plasmidi per aumentare il pool intracellulare di l-fenilalanina

A partire dal ceppo E. coli YHP05, la produzione di l-fenilalanina è stata ulteriormente migliorata dalla sovraespressione del gene basato sul plasmide. L’inibizione di feedback nella via di sintesi della l-fenilalanina da parte di shikimate e l-fenilalanina è stata ridotta mediante la sovraespressione di isozimi o l’introduzione di mutazioni negli enzimi coinvolti nella via di shikimate come segue: (i) sovraespressione del gene 3-deossi-d-arabinoheptulosonate 7-fosfato (DAHP) sintasi che è codificato in aroG con ingegneria (AroG8/15), (ii) sovraespressione dei geni ydiB e aroK che codificano shikimate deidrogenasi e shikimate chinasi per aumentare il flusso di carbonio nel percorso shikimate, (iii) sovraespressione del gene pheA che codifica CHA mutasi/prefenato deidratasi con ingegneria per il miglioramento dell’affinità di legame del substrato (PheAfbr, dm), e (iv) sovraespressione dei geni galP (galattosio permeasi) e glk (glucochinasi) per facilitare l’assorbimento del glucosio (Additional file 4: Figura S4).

In primo luogo, per alleviare l’inibizione del feedback, è stato costruito il plasmide pTac15kG, che conteneva il gene ingegnerizzato aroG8/15. AroG è il principale enzima coinvolto nella sintesi di DAHP, ma AroG è completamente inibito dalla l-fenilalanina (a partire da 0,1 mM). È noto che l’introduzione di due mutazioni (D146N e A202T) ha portato alla resistenza all’inibizione del feedback senza influenzare la sua alta attività specifica (AroG8/15), quindi abbiamo sovraespresso questo enzima AroG8/15 mutante. Successivamente, due plasmidi (pTac15kGB e pTac15kGBK) sono stati costruiti per sovraesprimere i geni ydiB e aroK insieme al gene aroG8/15, rispettivamente. Il flusso metabolico verso il percorso shikimate può essere aumentato quando shikimate deidrogenasi (YdiB) e shikimate chinasi (AroK) sono sovraespressi. Inoltre, il plasmide pTac15kGBKA è stato successivamente costruito per sovraesprimere il gene pheA che codifica la chorismate mutase/prefenate dehydratase con mutazioni. In questo costrutto, abbiamo amplificato solo i primi 300 aminoacidi di PheA wild-type (PheAfbr), che esclude il dominio regolatore; quindi, PheAfbr è debolmente influenzato dall’inibizione di feedback. Inoltre, poiché PheAfbr ha un valore Km più alto rispetto al wild-type PheA, che riflette la sua diminuita affinità di legame al substrato, abbiamo introdotto due mutazioni (E159A e E232A) in PheAfbr per migliorare la sua affinità di legame al substrato, ottenendo PheAfbr, dm . Infine, il plasmide pYHP è stato costruito per sovraesprimere anche i geni galP e glk, che codificano rispettivamente la galattosio permeasi e la glucochinasi. Entrambi gli enzimi facilitano l’assorbimento del glucosio.

Dopo la costruzione di cinque plasmidi, tra cui pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, e pYHP (Tabella 1), ogni plasmide è stato trasformato in E. coli YHP05. Dopo la coltivazione per 48 ore in palloni scuotenti contenenti mezzi semi-definiti, sono stati analizzati la crescita cellulare e il titolo di produzione di l-fenilalanina. Tutte le cellule sono cresciute bene, e in particolare E. coli YHP05 che ospita pYHP è cresciuta ad una densità cellulare marginalmente più alta (OD600 = 9,76) rispetto alle altre (Fig. 4b). Abbiamo anche analizzato il titolo di produzione di l-fenilalanina nel surnatante della cultura tramite HPLC. La sovraespressione del gene aroG8/15 (pTac15kG) ha portato ad un aumento significativo della produzione di l-fenilalanina (2,25 g/L) rispetto a YHP05 che non ospitava alcun plasmide (0,52 g/L) (Fig. 4b). La successiva sovraespressione di altri geni ha portato ad un aumento seriale del titolo di produzione di l-fenilalanina e, E. coli YHP05 harboring pYHP ha mostrato il più alto titolo di produzione di l-fenilalanina (3,91 g/L) (Fig. 4b). L’effetto del plasmide pYHP ha portato a un aumento significativo della produzione di l-fenilalanina fino a 16,4 volte e 7,5 volte, rispettivamente. Nella coltivazione di E. coli YHP05 che ospita pYHP, la resa di l-fenilalanina su glucosio e la produttività erano 0,270 g/g e 0,082 g/L/h, rispettivamente (file aggiuntivo 5: Figura S5). Così, nell’E. coli YHP05 ingegnerizzata che ospita pYHP, il pool di l-fenilalanina è stato significativamente migliorato. Liu et al. hanno precedentemente riportato la produzione di l-fenilalanina in E. coli fino a 47 g/L . Tuttavia, questo record potrebbe essere raggiunto nella coltivazione fed-batch (scala 15 L) e hanno impiegato la co-espressione del trasportatore di l-fenilalanina (YddG) per la produzione efficiente di l-fenilalanina nel mezzo di coltura. Nel nostro lavoro, non abbiamo introdotto l’YddG perché l’obiettivo finale del nostro lavoro non era la produzione di l-fenilalanina ma la produzione di cinnamaldeide. Anche se il titolo di l-fenilalanina raggiunto nel nostro lavoro non era il record alto, abbiamo pensato che fosse abbastanza alto per la produzione di cinnamaldeide. Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare questo ceppo ingegnerizzato per la produzione di cinnamaldeide.

Produzione di cinnamaldeide nell’E. coli ingegnerizzato

Utilizzando l’E. coli ingegnerizzato YHP05 che ospita pYHP, abbiamo prima esaminato la produzione di acido cinnamico. Per questo esperimento, è stato costruito il plasmide pHB-CA, che contiene il gene SmPAL sotto il promotore trc inducibile da IPTG (Tabella 1). E. coli YHP05 che ospita sia pHB-CA che pYHP è stata coltivata in fiasche per 48 ore ed è stato analizzato il titolo di produzione di acido cinnamico. E. coli YHP05 e E. coli W3110 con pHB-CA (senza pYHP) sono state esaminate come controlli. I modelli di crescita di tutte le cellule erano simili (Fig. 5a) e, E. coli W3110 e YHP05 harboring pHB-CA hanno prodotto 79 e 108 mg/L di acido cinnamico, rispettivamente (Fig. 5b). E. coli YHP05, che ospita sia pHB-CA che pYHP, ha esibito un titolo di produzione significativamente migliore (287 mg/L), che era 3,6 volte e 2,7 volte superiore a quelli di E. coli W3110 e YHP05 che ospita pHB-CA, rispettivamente (Fig. 5b). Per quanto ne sappiamo, questo titolo di produzione era anche 1,5 volte superiore al livello più alto (186 mg/L) riportato in E. coli. Questo risultato indica chiaramente che l’aumento della quantità di l-fenilalanina nel ceppo di E. coli ingegnerizzato contribuisce positivamente ad aumentare la produzione di acido cinnamico.

Come obiettivo principale, abbiamo esaminato la produzione di cinnamaldeide nel ceppo ingegnerizzato E. coli YHP05, trasformato con pHB-CAD e pYHP. Inoltre, E. coli YHP05 e E. coli W3110 con pHB-CAD (senza pYHP) sono stati esaminati come controlli. La crescita della cellula era simile (Fig. 6a), e tre enzimi biosintetici della cinnamaldeide erano ben espressi in tutte le cellule esaminate (Additional file 6: Figura S6). Dopo la coltivazione in fiasco per 48 ore, i surnatanti della cultura sono stati raccolti e i titoli di produzione di cinnamaldeide sono stati determinati mediante HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) e E. coli YHP05 (pHB-CAD) hanno esibito titoli di produzione di cinnamaldeide fino a 2,18 e 6,3 mg/L, rispettivamente (Fig. 6b). Al contrario, E. coli YHP05 (pHB-CAD e pYHP) ha mostrato un titolo di produzione significativamente più alto (75 mg/L), che era 35 volte superiore a quello di E. coli W3110 (pHB-CAD).

Attività nematicida della cinnamaldeide prodotta da E. coli ingegnerizzata

Per valutare l’attività nematicida della cinnamaldeide prodotta nel terreno di coltura, i nematodi, B. xylophilus, sono stati trattati con cinnamaldeide seguendo le procedure come descritto in “Metodi”. Il surnatante della coltura di E. coli YHP05 con pYHP e pHB-CAD è stato diluito fino alla concentrazione finale di cinnamaldeide di 60 mg/L e i nematodi sono stati trattati con il surnatante diluito. Dopo 1 e 4 ore, solo il 26% e meno del 18% dei nematodi sono sopravvissuti, rispettivamente (Fig. 7). Come controllo positivo, i nematodi sono stati trattati con cinnamaldeide disponibile in commercio e purificata a una concentrazione equivalente (60 mg/L). Dopo 4 ore, quasi tutti i nematodi (95%) sono stati uccisi. Questi risultati hanno indicato che le attività nematocide erano simili tra la cinnamaldeide acquistata in commercio e quella prodotta in questo studio. Come controllo negativo, è stato testato anche il surnatante della coltura di E. coli W3110 e, come previsto, quasi tutti i nematodi sono sopravvissuti (>92%) dopo 4 ore.