Risultati e discussione
Due modalità di scissione del DNA da parte di R.KpnI in presenza di Mg2+.
R.KpnI è una REasi altamente promiscua nelle reazioni catalizzate da Mg2+, a differenza di molte altre REasi (11, 12). In Fig. 1 A, il caratteristico modello di scissione da R.KpnI è mostrato in una gamma di concentrazioni di Mg2+. A concentrazioni più basse dello ione metallico (50-500 μM), solo la scissione della sequenza cognato è stato osservato (corsie 2-5). Tuttavia, a concentrazioni di Mg2+ >500 μM, la scissione promiscua era evidente (corsie 6-9). Le modalità specifiche e promiscue di scissione da parte di R.KpnI a seconda della concentrazione di Mg2+ sono state confermate dall’analisi della scissione di oligonucleotidi. Il substrato oligonucleotidico contenente la sequenza canonica è stato scisso in modo efficiente da R.KpnI anche a 20 μM Mg2+. Al contrario, le sequenze non canoniche sono state scisse in modo efficiente solo a >500 μM Mg2+ . Questi risultati implicano che R.KpnI esibisce due diversi profili di attivazione del metallo, uno per i substrati di DNA canonici e l’altro per quelli non canonici. L’enzima segue un profilo iperbolico di attivazione del metallo per il substrato canonico e un modello sigmoidale per il substrato non canonico (Fig. 1 B). Questi dati sono stati sottoposti ad analisi Hill plot (Fig. S2; e vedi testo SI), e il coefficiente di Hill per il legame degli ioni metallici è presentato nella tabella 1. Hill plot analisi ha rivelato il legame di ioni metallici aggiuntivi per l’enzima e il suo ruolo nella scissione di sequenze non canoniche. Così, il reclutamento di uno ione metallico aggiuntivo vicino o lontano dal sito attivo dell’enzima sembrava essere necessario per indurre la scissione promiscua da parte dell’enzima. Se questo è il caso, la mutazione dei residui coinvolti nella coordinazione dello ione metallico del secondo sito dovrebbe abolire l’attività promiscua, risultando in un enzima altamente sequenza-specifico. Abbiamo testato questa ipotesi.