Cromatografia liquida-spettrometria di massa nell’analisi degli alimenti

La determinazione dei composti organici in tracce nell’analisi degli alimenti è di grande importanza per gli aspetti di qualità e sicurezza alimentare. Sia la separazione dell’analita da potenziali inferenze nella matrice alimentare, sia la determinazione qualitativa e quantitativa del composto target, sono passi vitali nella chimica alimentare analitica.

Definizione

La cromatografia liquida (LC, qui High Performance LC – HPLC) è una tecnica di separazione fisica per l’analisi delle tracce. Si basa sull’interazione di un analita con una fase stazionaria (colonna con particelle) e una fase mobile (eluente liquido o una miscela di eluenti). La spettrometria di massa (MS) è lo strumento analitico per misurare la composizione di un campione. La MS genera informazioni utili sul peso molecolare e la struttura degli analiti e aiuta nell’elucidazione di composti sconosciuti.

La combinazione, LC/MS, LC-MS è una tecnica potente, a causa della sua sensibilità molto alta (fino all’intervallo ppt) e specificità. Nel campo dell’analisi delle tracce organiche, la MS viene utilizzata per molte applicazioni, ma a differenza della GC/MS (Gas Chromatography, coupled with Mass Spectrometry), è dedicata all’analisi di campioni che contengono target analitici non volatili, tipicamente con una massa tra 200 – 800u, che sono termicamente labili, mostrano un’alta polarità o hanno un’alta massa molecolare.

Principio di funzionamento

In linea di principio, un dispositivo LC/MS deve eseguire le quattro fasi di lavoro, tra cui:

1. Separazione cromatografica degli analiti tramite una colonna di separazione
2. Ionizzazione dell’analita
3. Isolamento degli ioni e
4. Identificazione degli ioni

In generale, non è banale interfacciare un sistema HPLC con uno spettrometro di massa, poiché la difficoltà è trasformare un soluto in uno ione in fase gassosa. La sfida consiste nel liberarsi del solvente mantenendo un livello di vuoto adeguato nello spettrometro di massa e nel generare gli ioni in fase gassosa. Pertanto, i componenti che eluiscono dalla colonna cromatografica sono introdotti nello spettrometro di massa attraverso un’interfaccia specializzata.

I due sistemi di interfaccia di ionizzazione più utilizzati, la ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) e la ionizzazione elettrospray (ESI) sono scelti in base alle proprietà fisico-chimiche degli analiti (cioè polarità e acidità). La ionizzazione avviene a pressione atmosferica ed entrambi sono considerati un metodo di ionizzazione soft, cioè lo spettro di massa fornisce principalmente l’informazione del peso molecolare, a meno che non si utilizzino tecniche di frammentazione.

Poiché i composti sono in parte co-eluiti dal sistema cromatografico, la chiara assegnazione dei singoli frammenti non può essere realizzata utilizzando solo LC-MS, dove sono disponibili solo le masse degli ioni molecolari. Per superare questo problema, la spettrometria di massa tandem (MS/MS), che coinvolge più passi di selezione di massa o analisi, è oggi principalmente utilizzato (LC/MS/MS o LC/MSn). Questi sistemi sono in grado di determinare i residui nell’intervallo di ppt inferiore. Per la qualificazione delle molecole organiche, è necessario un diverso setup tecnico MS. Un possibile approccio per la qualificazione è l’uso di una MS che genera ioni, che li porta ad una trappola ionica lineare e poi li memorizza in un campo a radiofrequenza. In seguito, diverse possibilità tecniche permettono la qualificazione degli ioni e quindi del composto sconosciuto.

Applicazioni

Dalla sua introduzione nell’analisi di routine circa dieci anni fa, la LC/MS si è affermata nella maggior parte dei settori della chimica analitica, ad esempio nel controllo di qualità, nella ricerca fondamentale e applicata e nel controllo governativo.

I seguenti esempi forniscono una breve panoramica:

a) Farmacia

• Studi di farmacocinetica dei farmaci, ad esempio processi di degradazione dei farmaci
• Sviluppo di farmaci, ad esempio identificazione dei metaboliti o delle impurità

b) Biologia molecolare

• Proteomica, per esempio studio su larga scala delle proteine, in particolare delle loro strutture e funzioni
• Metabolomica, per esempiog. determinazione di intermedi metabolici, ormoni e altre molecole di segnalazione

c) Ambiente

• Acqua di scarico, per esempio composti endocrini
• Suolo, per esempio organometallici

d) Cibo

• Ingredienti, per esempio aminoacidi, lipidi
• Contaminanti, per esempio analisi multiresiduo di pesticidi, tossine dei frutti di mare, residui veterinari, determinazione di coloranti, acrilamide, analisi delle microcistine
• Prodotti naturali, ad es. terpeni, steroidi

Tensidi perfluorati (PFC) come esempio nell’analisi degli alimenti

Sfondo

Il PFC è un esempio eccellente per combinare la complessa preparazione del campione con sofisticati dispositivi LC/MS e una profonda conoscenza della chimica analitica. Le proprietà uniche dei PFT li rendono utili in una serie di prodotti industriali e commerciali, come i fluidi di raffreddamento, i polimeri e come componenti in prodotti farmaceutici e pesticidi. In particolare, i carbossilati perfluorinati (ad esempio PFOA – acido perfluoroottanoico) e i solfonati perfluorinati (ad esempio PFOS – acido perfluoroottansulfonico) sono utilizzati come tensioattivi, ad esempio per impregnare tessuti e tappeti, nelle schiume antincendio e per trattamenti antigrasso nell’industria della carta. Il PFC viene prodotto da oltre 50 anni ed è distribuito in tutto il mondo. Se i legami C-H non sono completamente sostituiti da legami C-F, uno dei più forti legami chimici conosciuti, la degradazione è ancora possibile.

Solo PFOA e PFOS sono valutati tossicologicamente (tossici cronici e cancerogeni), tutti gli altri composti omologhi, isomeri ecc. non sono ancora valutati. Da un punto di vista fisico, i PFC sono sia persistenti (cioè non degradabili) che mobili (cioè possono percolare dai suoli contaminati nelle acque sotterranee). Questo rappresenta una minaccia permanente nel contesto dell’estrazione e/o del condizionamento dell’acqua potabile. Inoltre, i trasferimenti di piante introducono questi composti nella catena alimentare.

Le scoperte di alti livelli di contaminazione da PFC in due fiumi tedeschi nel 2006 hanno attirato l’interesse pubblico verso questi composti.

L’inquinamento del 2006 potrebbe aver avuto origine dai fanghi organici, applicati come fertilizzante per scopi agricoli. È stato dimostrato che il suolo contiene fino a 600 µg PFC/kg, causando la contaminazione dell’acqua potabile e degli impianti di approvvigionamento. Finora, sette stati federali tedeschi hanno segnalato la contaminazione da PFC.

Fraunhofer IME

Una delle competenze principali del Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology è lo sviluppo di metodi fattibili e affidabili per l’identificazione e l’analisi di contaminanti chimici in matrici alimentari e ambientali.

Dal 1999, il Fraunhofer IME ha condotto progetti per misurare la contaminazione da PFC in varie matrici ambientali. Questo lavoro è stato condotto per conto di partner industriali e si è concentrato in particolare su PFC-carbossilati e PFC-solfonati. Ulteriori indagini sono state condotte per conto del programma di monitoraggio della banca federale tedesca di campioni ambientali, che ha incluso anche campioni di sangue umano. Nel 2005, sono state condotte le prime indagini nell’area dei prodotti alimentari e nel 2006, i risultati di campioni alimentari selezionati (ad esempio, latte materno, patatine fritte) sono stati discussi anche nei media. Nel 2007 sono stati condotti progetti più grandi incentrati sul trasferimento di piante, patate e prodotti, matrici umane (sangue e latte materno), nonché campioni ambientali (ad esempio acque reflue, fanghi e suolo).

Soluzione analitica

Sono state applicate tre diverse preparazioni di campioni per coprire tutte le possibili matrici di campioni:

• IPE (Ion pair extraction). Uso dell’agente di accoppiamento ionico tetra-n-butilammonio idrogensolfato seguito da un’estrazione liquida solida (ad esempio campioni ambientali)
• AAE (estrazione acido-alcalina). Rimozione dei lipidi con esano a pH 14 (soluzione liquida di ammoniaca), aggiustamento a pH 1 con acido cloridrico ed estrazione con terz-butil metil etere (es. latte materno)
• SPE (estrazione in fase solida, metodo attualmente più citato) con cartucce di diversa polarità a seconda del carattere ionico del PFC in un mezzo tamponato (es.L’uso di standard interni per la calibrazione è altamente raccomandato; attualmente, i nostri metodi includono nove standard di PFC marcati in massa. Prima di introdurre i campioni nella LC/MS, il dispositivo stesso deve essere controllato per le parti di ricambio rivestite in teflon, perché contengono PFC emettitore che influenzerà i risultati in modo non riproducibile. Queste parti devono essere sostituite, il che richiede una conoscenza superiore dei componenti LC/MS.

  Esempio analitico

  Per le analisi di patate crude e prodotti a base di patate, abbiamo regolato la nostra LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 con Quattro Ultima Pt in modalità Electrospray negativo, entrambi i Waters; 150 x 2 mm colonna Luna 3 µm C18(2), Phenomenex) per le masse target di 9 acidi perfluorocarbossilici (C4 – C12) e 3 acidi perfluorosolfonici (C4, C6, C8) utilizzando materiali di riferimento marcati con 13C (LOQ 0.5 µg/Kg) dopo una preparazione del campione SPE.

  I PFC hanno mostrato una diversa distribuzione nella patata cruda e nei prodotti a base di patate, (Tabella 1) che permette di ipotizzare una contaminazione durante la lavorazione, così come la contaminazione del suolo. Questo può essere supportato dalle nostre indagini sulle patatine fritte PFC del 2006, dove abbiamo analizzato le patatine fritte dei ristoranti fast food e abbiamo trovato fino a 2,8 µg PFOA/kg e fino a 0,9 µg PFOS/kg.

  

  Sguardo analitico

  Il Fraunhofer IME ha una significativa competenza ed esperienza nell’analisi dei PFC, che potrebbe essere applicata a molte aree di contaminazione ambientale / alimentare PFC che devono ancora essere studiate. Aree importanti per la ricerca futura sui PFC possono includere l’aumento del numero di analiti, molti PFC a catena corta e lunga sono già inclusi nel nostro programma di studio, ma la nostra capacità analitica potrebbe essere migliorata includendo ulteriori PFC. I PFC aggiuntivi devono essere identificati tramite LC/MS perché gli standard commerciali non sono disponibili. Questo porterà a risultati consolidati dei precursori, dei percorsi di contaminazione alimentare e della degradazione durante la lavorazione degli alimenti.