Condensatori di sottostadio

Il condensatore di sottostadio raccoglie la luce dalla sorgente luminosa del microscopio e la concentra in un cono di luce che illumina il campione con intensità uniforme su tutto il campo visivo. È fondamentale che il cono di luce del condensatore sia regolato correttamente per ottimizzare l’intensità e l’angolo della luce che entra nella lente frontale dell’obiettivo. Ogni volta che un obiettivo viene cambiato, una regolazione corrispondente deve essere eseguita sul condensatore di sottostadio per fornire il cono di luce corretto per l’apertura numerica del nuovo obiettivo.

Un semplice condensatore di Abbe a due lenti è illustrato nella figura 1. In questa figura, la luce proveniente dalla fonte di illuminazione del microscopio passa attraverso il diaframma di apertura del condensatore, situato alla base del condensatore, ed è concentrata dagli elementi di lenti interne, che poi proiettano la luce attraverso il campione in fasci paralleli da ogni azimut. La dimensione e l’apertura numerica del cono di luce è determinata dalla regolazione del diaframma di apertura. Dopo aver attraversato il campione (sul vetrino del microscopio), la luce diverge in un cono invertito con l’angolo appropriato per riempire la lente anteriore dell’obiettivo.

La regolazione dell’apertura e la corretta messa a fuoco del condensatore sono di importanza critica per realizzare il pieno potenziale dell’obiettivo. In particolare, l’uso appropriato del diaframma a iride ad apertura regolabile (incorporato nel condensatore o appena sotto di esso) è molto importante per assicurare una corretta illuminazione, contrasto e profondità di campo. L’apertura e la chiusura di questo diaframma a iride controlla l’angolo dei raggi illuminanti (e quindi l’apertura) che passano attraverso il condensatore, attraverso il campione e poi nell’obiettivo. I visitatori sono invitati ad esplorare come cambiare l’apertura del condensatore ha effetti sul cono di illuminazione nel nostro tutorial interattivo Java che esplora l’apertura numerica del condensatore. L’altezza del condensatore è controllata da un sistema a pignone e cremagliera che permette di regolare la messa a fuoco del condensatore per una corretta illuminazione del campione. Il corretto posizionamento del condensatore rispetto al cono di illuminazione e alla messa a fuoco è fondamentale per la microscopia quantitativa e la fotomicrografia ottimale.

Si deve fare attenzione a garantire che l’apertura del condensatore sia aperta nella posizione corretta rispetto all’apertura numerica dell’obiettivo. Quando il diaframma di apertura del condensatore è troppo aperto, la luce parassita generata dalla rifrazione dei raggi di luce obliqui dal campione può causare abbagliamento e abbassare il contrasto generale. D’altra parte, quando l’apertura è troppo piccola, il cono di illuminazione è insufficiente per fornire una risoluzione adeguata e l’immagine è distorta a causa della rifrazione e diffrazione dal campione. I visitatori possono esplorare questi fenomeni con il nostro Tutorial Java interattivo sull’apertura del condensatore che dimostra l’effetto della posizione dell’apertura del condensatore sull’illuminazione del campione.

I condensatori sono divisi in classificazioni di scopo (per esempio: campo chiaro, campo scuro, contrasto di fase, ecc.), e anche secondo il loro grado di correzione ottica. Ci sono quattro tipi principali di condensatori per quanto riguarda la correzione delle aberrazioni ottiche, come elencato nella tabella 1.

Il condensatore più semplice e meno corretto (anche il meno costoso) è quello di Abbe che può avere un’apertura numerica fino a 1.4 nei modelli di fascia alta con tre o più elementi di lenti interne. Mentre il condensatore di Abbe è in grado di far passare la luce brillante, non è corretto per le aberrazioni ottiche cromatiche o sferiche. Un tipico condensatore di Abbe è illustrato nella figura 2. Nella sua forma più semplice, il condensatore di Abbe ha due elementi ottici che producono un’immagine del diaframma di campo illuminato che non è nitida ed è circondata da colore blu e rosso ai bordi.

A causa dell’assenza di correzione ottica, il condensatore di Abbe è adatto principalmente per l’osservazione di routine con obiettivi di modesta apertura numerica e ingrandimento. I vantaggi principali del condensatore di Abbe sono l’ampio cono di illuminazione che il condensatore è in grado di produrre e la sua capacità di lavorare con obiettivi a lunga distanza di lavoro. La maggior parte dei microscopi viene fornita dal produttore con un condensatore di Abbe come impostazione predefinita e questi condensatori sono veri e propri cavalli di battaglia per l’uso di routine in laboratorio.

Il livello successivo di correzione del condensatore è diviso tra i condensatori aplanatici e acromatici che sono corretti esclusivamente per le aberrazioni ottiche sferiche (aplanatiche) o cromatiche (acromatiche). Esempi tipici di questi condensatori sono illustrati nelle figure 3 (acromatico) e 4 (aplanatico). I condensatori acromatici di solito contengono da tre a quattro elementi di lenti e sono corretti in due lunghezze d’onda (rosso e blu) per l’aberrazione cromatica.

Il condensatore acromatico illustrato nella figura 3 contiene quattro elementi di lenti e ha un’apertura numerica di 0,95, la più alta ottenibile senza richiedere olio di immersione. Questo condensatore è utile sia per le analisi di routine che per quelle critiche di laboratorio con obiettivi “asciutti” e anche per la fotomicrografia in bianco e nero o a colori.

Un fattore critico nella scelta dei condensatori di sottostage è la performance di apertura numerica che sarà necessaria per fornire un cono di illuminazione adeguato agli obiettivi. L’apertura numerica del condensatore dovrebbe essere uguale o leggermente inferiore a quella dell’apertura numerica dell’obiettivo più alto. Pertanto, se l’obiettivo con l’ingrandimento più alto è un obiettivo a immersione in olio con un’apertura numerica di 1,40, allora il condensatore di sottostadio dovrebbe avere anche un’apertura numerica equivalente per mantenere la massima risoluzione del sistema. In questo caso, l’olio per immersione dovrebbe essere applicato tra la lente superiore del condensatore e il lato inferiore del vetrino del microscopio per ottenere l’apertura numerica prevista (1,40) e la risoluzione. Il mancato utilizzo dell’olio limiterà l’apertura numerica massima del sistema a 1,0, la massima ottenibile con l’aria come mezzo di imaging.

I condensatori aplanatici sono ben corretti per l’aberrazione sferica (lunghezze d’onda verdi) ma non per quella cromatica. Un tipico condensatore aplanatico con un’apertura numerica di 1,40 è illustrato nella figura 4. Questo condensatore ha cinque elementi di lenti ed è in grado di focalizzare la luce in un singolo piano. I condensatori aplanatici sono in grado di produrre eccellenti fotomicrografie in bianco e nero se usati con luce verde generata da una sorgente laser o dall’uso di un filtro di interferenza con illuminazione alogena al tungsteno.

Il più alto livello di correzione dell’aberrazione ottica è incorporato nel condensatore aplanatico-acromatico. Questo condensatore è ben corretto sia per le aberrazioni cromatiche che sferiche ed è il condensatore di scelta per l’uso nella fotomicrografia critica a colori con luce bianca. Un tipico condensatore aplanatico-acromatico è illustrato nella Figura 5 (apertura numerica = 1,35). Questo condensatore ha otto elementi di lenti interne cementate in due doppietti e quattro lenti singole.

Le incisioni che si trovano sul corpo del condensatore includono il suo tipo (acromatico, aplanatico, ecc.), l’apertura numerica, e una scala graduata che indica la regolazione approssimativa (dimensione) del diaframma di apertura. Come abbiamo detto sopra, i condensatori con aperture numeriche superiori a 0,95 funzionano meglio quando una goccia d’olio viene applicata alla loro lente superiore in contatto con la superficie inferiore del vetrino portacampioni. Questo assicura che i raggi di luce obliqui provenienti dal condensatore non vengano riflessi da sotto il vetrino, ma siano diretti nel campione. In pratica, questo può diventare noioso e non è comunemente fatto nella microscopia di routine, ma è essenziale quando si lavora ad alte risoluzioni e per la fotomicrografia accurata utilizzando obiettivi ad alta potenza (e apertura numerica).

Un’altra considerazione importante è lo spessore del vetrino del microscopio, che è cruciale per il condensatore come lo spessore del coprioggetto lo è per l’obiettivo. La maggior parte dei produttori commerciali offre vetrini con uno spessore compreso tra 0,95 e 1,20 mm, con il più comune molto vicino a 1,0 mm. Un vetrino da microscopio dello spessore di 1,20 mm è troppo spesso per essere usato con la maggior parte dei condensatori ad alta apertura numerica che tendono ad avere una distanza di lavoro molto breve. Mentre questo non ha molta importanza per l’osservazione di routine dei campioni, i risultati possono essere devastanti con la fotomicrografia di precisione. Si raccomanda di scegliere vetrini per microscopio con uno spessore di 1,0 ± 0,05 mm, e di pulirli accuratamente prima dell’uso.

Quando l’obiettivo viene cambiato, per esempio da un 10X a un 20X, anche il diaframma di apertura del condensatore deve essere regolato per fornire un nuovo cono di luce che corrisponde all’apertura numerica del nuovo obiettivo. Questo viene fatto girando la manopola zigrinata sui condensatori illustrati nelle figure 2-6. C’è una piccola freccia gialla o un segno di indice situato su questa manopola che indica la dimensione relativa dell’apertura rispetto alla gradazione lineare sull’alloggiamento del condensatore. Molti produttori sincronizzano questa gradazione per corrispondere all’apertura numerica approssimativa del condensatore. Per esempio, se il microscopista ha selezionato un obiettivo 10X di apertura numerica 0.25, allora la freccia sarà posta accanto al valore 0.18-0.20 (circa l’80% dell’apertura numerica dell’obiettivo) sulla gradazione inscritta sull’alloggiamento del condensatore.

Spesso non è pratico usare un solo condensatore con un’intera gamma di obiettivi (da 2X a 100X) a causa dell’ampia gamma di coni di luce che devono essere prodotti per corrispondere alle aperture numeriche degli obiettivi. Con obiettivi a bassa potenza nella gamma da 2X a 5X, il cono di illuminazione avrà un diametro tra 6-10 mm, mentre gli obiettivi ad alta potenza (da 60X a 100X) hanno bisogno di un cono di luce altamente focalizzato solo circa 0,2-0,4 mm di diametro. Con una lunghezza focale fissa, è difficile ottenere questa vasta gamma di coni di illuminazione con un singolo condensatore.

In pratica, questo problema può essere risolto in diversi modi. Per gli obiettivi di bassa potenza (sotto i 10x), può essere necessario svitare la lente superiore del condensatore per riempire di luce il campo visivo. Alcuni condensatori sono prodotti con una lente superiore flip-top per realizzare questo più facilmente, come illustrato nella Figura 6. Molti produttori ora producono un condensatore che si ribalta completamente quando viene usato con obiettivi di bassa potenza. Altre aziende possono incorporare lenti di correzione ausiliarie nel percorso della luce per garantire una corretta illuminazione con obiettivi inferiori a 10x. Quando il condensatore è usato senza la sua lente superiore, il diaframma a iride dell’apertura è aperto e il diaframma di campo, ora visibile sul retro dell’obiettivo, serve come se fosse il diaframma di apertura. I condensatori Flip-top sono prodotti in una varietà di configurazioni con aperture numeriche che vanno da 0,65 a 1,35. I condensatori che hanno un valore di apertura numerica di 0,95 o meno sono destinati all’uso con obiettivi “asciutti”. Tuttavia, i condensatori flip-top che hanno un’apertura numerica maggiore di 0,95 sono destinati all’uso con obiettivi a immersione in olio e devono avere una goccia d’olio posta tra il fondo del vetrino del microscopio e la lente superiore del condensatore quando si esaminano campioni critici.

In aggiunta ai comuni condensatori per campo chiaro discussi sopra, ci sono una grande varietà di modelli specializzati adatti a molte applicazioni diverse. La tabella 2 elenca una serie di diverse configurazioni di condensatori e le applicazioni previste.

Dai dati della tabella 2, è ovvio che i condensatori di sottostage hanno una grande intercambiabilità tra diverse applicazioni. Per esempio, il condensatore acromatico/aplanare universale DIC è utile per campo chiaro, campo scuro e contrasto di fase, oltre all’applicazione DIC primaria. Altri condensatori hanno un’intercambiabilità simile. Tratteremo i vari aspetti delle singole tecniche che richiedono condensatori modificati nella nostra sezione sulle tecniche di microscopia specializzata. Sentitevi liberi di visitare questa interessante parte del nostro sito web per informazioni più specifiche sui condensatori substage.