DISCUSSIONE
Citrobacter è una causa significativa di infezioni opportunistiche; C. diversus è associato a circa il 40% dei casi presentati, mentre C. freundiirepresenta circa il 29% (11). Citrobacterspp. causa meningite neonatale e ha un’insolita propensione a causare ascesso cerebrale (8, 14). La patogenesi di Citrobacter spp. che causa meningite e ascesso cerebrale non è ben caratterizzata; tuttavia, come con altri batteri che causano meningite, la penetrazione della barriera emato-encefalica deve avvenire. Il presente studio è stato intrapreso per comprendere meglio le potenziali interazioni di Citrobacter con la barriera emato-encefalica. C. freundii è stato scelto come batterio modello per questi studi perché la genetica del batterio è meglio definita e una biblioteca genomica è disponibile per eventuali studi riguardanti la base molecolare dell’invasione e della replicazione di Citrobacter in HBMEC. Gli esperimenti condotti con un isolato del liquido cerebrospinale di C. diversus hanno dato risultati simili (dati non mostrati), suggerendo che la frequenza e il meccanismo di invasione delle HBMEC per queste due specie possono essere simili.
La barriera emato-encefalica è una struttura complessa che consiste nell’epitelio del plesso coroideo e nell’endotelio dei capillari cerebrali. La presenza di giunzioni strette e la bassa attività pinocitotica delle cellule endoteliali si traduce nella limitazione dei macroelementi che passano attraverso la barriera emato-encefalica. In questo momento, non è noto dove nella barriera emato-encefalica C. freundii penetra, ma il plesso coroideo è stato trovato raramente coinvolto nel modello di ratto neonato di meningite ematogena sperimentale da Citrobacter (16). Inoltre, le cellule endoteliali microvascolari coprono la più grande superficie della barriera emato-encefalica, e altri batteri che causano la meningite hanno dimostrato di invadere le cellule endoteliali microvascolari in vitro (13, 20, 25). Abbiamo quindi selezionato le HBMEC per il nostro studio. I saggi di invasione in coltura tissutale e gli studi TEM hanno dimostrato che C. freundii invade le HBMEC. I risultati dei test di invasione eseguiti in presenza di vari inibitori cellulari eucariotici suggeriscono che l’invasione di C. freundii nelle HBMEC è un processo dipendente da microfilamenti, microtubuli, sintesi proteica de novo e acidificazione dell’endosoma. I test di invasione estesa hanno determinato che C. freundii può sopravvivere e replicarsi intracellularmente per periodi prolungati in vitro. Le analisi TEM hanno rivelato che la posizione intracellulare delle cellule individuali e multiple di C. freundii è all’interno di strutture simili a vacuoli a membrana singola. Gli esperimenti Transwell hanno dimostrato che C. freundii potrebbe attraversare un monostrato polarizzato di HBMEC, mentre E. coli non invasivo non potrebbe. Inoltre, i nostri dati preliminari mostrano che C. freundii penetra la barriera emato-encefalica nel modello di ratto neonatale di meningite ematogena sperimentale (21). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che C. freundii invade i vacuoli, probabilmente si replica, transcitalizza attraverso le HBMEC, viene rilasciato nel lato basolaterale, e quindi penetra la barriera emato-encefalica.
Invasione di cellule eucariotiche da parte di C. freundii è stata riportata (22, 35). Tuttavia, questo è il primo rapporto sull’invasione di HBMEC da parte di C. freundii. Curiosamente, i requisiti eucariotici per l’invasione di C. freundii sono tanto diversi quanto i tipi di cellule che C. freundii ha dimostrato di invadere. Per esempio, l’inibitore della fossa rivestita di clatrina MDC ha dimostrato di inibire l’invasione di C. freundii in tutti gli altri tipi di cellule testate (per esempio, cellule epiteliali umane vascolari, intestinali e vescicali) tranne, come mostrato in questo studio, HBMEC. Inoltre, altri batteri che causano la meningite caratterizzati finora entrano nelle HBMEC in un percorso che dipende dai microtubuli ed è sensibile al MDC (20, 24, 27). Gli inibitori dei pozzi rivestiti di clatrina MDC e ouabain non hanno dimostrato di inibire tutti i recettori; quindi, può essere che il recettore necessario per l’invasione di C. freundii in HBMEC non sia influenzato dall’inibitore MDC o ouabain. Anche se le prove raccolte finora suggeriscono che l’ingresso di C. freundii in HBMEC potrebbe non avvenire attraverso una via mediata da un recettore sensibile a MDC o oabain, sembra che l’acidificazione dell’endosoma e la sintesi proteica de novo siano entrambe necessarie. I dati disponibili suggeriscono due possibili scenari. L’acidificazione dell’endosoma può essere necessaria come trigger ambientale per la sopravvivenza batterica intracellulare. Requisiti simili sono stati caratterizzati per l’invasione epiteliale di Salmonella (26). In alternativa, l’acidificazione dell’endosoma e la sintesi proteica possono essere necessarie per la separazione del complesso ligando-recettore, la sintesi del recettore, e/o la presentazione del recettore alla superficie delle HBMEC affinché avvenga l’invasione di C. freundii. Quest’ultimo scenario ricorda altri patogeni invasivi, dove il contatto dell’organismo vitale è necessario per la modulazione delle molecole di adesione delle cellule eucariotiche che sono necessarie per l’invasione (ad esempio, Streptococcus pneumoniae e recettore del fattore attivante le piastrine) (2). Sono in corso esperimenti nel nostro laboratorio per distinguere tra questi scenari proposti.
Saggi di invasione eseguiti in presenza di inibitori del microtubulo (sia agenti depolimerizzanti che stabilizzanti) hanno diminuito significativamente la capacità delle HBMEC di assorbire C. freundii. Esperimenti di microscopia confocale con anticorpi anti-α-tubulina hanno mostrato che i microtubuli si aggregano dopo che le HBMEC vengono a contatto con C. freundii. L’aggregazione dei microtubuli era un processo dipendente dal tempo; nessuna aggregazione è stata vista a 5 minuti, poca a 15 minuti, e una chiara aggregazione è stata osservata dopo 30 minuti di incubazione di C. freundii con HBMEC. Questa aggregazione dei microtubuli è stata inibita quando le cellule sono state trattate con inibitori dei microtubuli o agenti inibitori dei microfilamenti. È interessante notare che il modello di colorazione dell’aggregazione dei microtubuli non si è colocalizzato con il legame batterico e le aree di HBMEC che non hanno mostrato il legame con C. freundii hanno anche dimostrato un pronunciato raggruppamento dei microtubuli. Questo suggerisce che il contatto dei batteri con le HBMEC può stimolare globalmente l’aggregazione dei microtubuli. Se l’aggregazione dei microtubuli sia il risultato di un fattore batterico secreto o di una risposta paracrina al legame dei batteri con le HBMEC resta da vedere. Inoltre, l’aggregazione dei microtubuli in risposta al legame con C. freundii può essere collegata alla presentazione postulata del recettore attraverso la sintesi proteica de novo e l’acidificazione dell’endosoma. È stato precedentemente dimostrato che il trasporto di molti recettori da e verso la superficie cellulare dipende dai microtubuli (10). Pertanto, una spiegazione dell’effetto inibitorio degli inibitori del microtubulo sull’ingresso di C. freundii nelle HBMEC è che gli agenti possono diminuire il numero di recettori HBMEC che mediano l’invasione di C. freundii. Sono in corso esperimenti per discernere tra queste possibilità.
I microtubuli hanno precedentemente dimostrato di essere necessari per l’invasione di molti patogeni (ad esempio, Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, E. coli enteropatogeno ed enteroemorragico, e Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Il pensiero generale è stato che anche se questi patogeni possono entrare attraverso vie dipendenti dai microtubuli, di solito non si replicano intracellularmente (6). I dati acquisiti in questo studio dai test di invasione estesa e dall’analisi TEM suggeriscono che C. freundii può essere un’eccezione a questa generalizzazione. In contrasto con ciò che è stato descritto per un altro batterio replicante intravaculare, Legionella pneumophila (12), non c’è stata alcuna comparsa di mitocondri o ribosomi nelle immediate vicinanze dei batteri. Questo suggerisce che C. freundii potrebbe non utilizzare questi organelli per ottenere direttamente energia o che il reclutamento di specifiche proteine della cellula ospite potrebbe non essere richiesto per la sopravvivenza intracellulare e la proliferazione (come nel caso di L. pneumophila). Di particolare rilevanza per le infezioni del sistema nervoso centrale, altri batteri che causano meningite come E. coli K1, GBS e S. pneumoniae hanno dimostrato di invadere (1, 13, 25) o invadere e transcytose (20, 27) BMEC; tuttavia, gli organismi non sono stati trovati per replicarsi all’interno di HBMEC. Come descritto sopra, la meningite da Citrobacter è stata documentata per la sua alta frequenza di formazione di ascessi cerebrali. Se la replicazione all’interno dei vacuoli HBMEC è unica per Citrobacter e se c’è una correlazione con la formazione di ascessi rimane da determinare.
La citochalasina D inibisce l’invasione di C. freundii in HBMEC; tuttavia, usando l’immunostaining, non abbiamo trovato alcuna riorganizzazione rilevabile dei microfilamenti quando C. freundii ha interagito con HBMEC (dati non mostrati). Inoltre, il pretrattamento con citochalsina D di HBMEC ha inibito l’aggregazione dei microtubuli dipendente dal batterio, come visualizzato dalla microscopia confocale. Ci possono essere diverse spiegazioni per questi risultati. L’effetto della citochalsina D sull’aggregazione dei microtubuli dipendente dal batterio può essere dovuto agli effetti indiretti dell’inibitore dei microfilamenti sulla rete dei microtubuli. Per esempio, è stato osservato che i microtubuli agiscono come strutture di ancoraggio per la F-actina (28). Pertanto, l’interruzione della rete di microfilamenti può influenzare la rete di microtubuli e quindi indirettamente l’invasione microtubulo-dipendente di C. freundii di HBMEC. In alternativa, una fase di invasione actina-dipendente può precedere una fase microtubulo-dipendente nell’invasione di C. freundii in HBMEC. Questa fase iniziale può risultare in una riorganizzazione dei microfilamenti quando i batteri sono inizialmente in contatto con le HBMEC; tuttavia questi eventi possono essere transitori, e il disegno sperimentale che utilizza la microscopia a immunofluorescenza può non rilevare adeguatamente la loro presenza. Una situazione simile si nota per l’invasione mediata da Yersiniainvasin (36). Pertanto, se le fasi iniziali dell’invasione sono impedite dalla citochalasina D, le fasi successive dell’invasione che dipendono dai microtubuli non sono innescate. È stato precedentemente dimostrato che l’actina funziona nella traslocazione di fattori proteici legati all’actina alla membrana plasmatica e nella segnalazione citosolica (19). Inoltre, la citochalasina D inibisce l’entrata di Salmonella attraverso l’interruzione della traslocazione delle proteine leganti l’actina al sito di entrata del batterio (7). È possibile che nel caso dell’invasione di C. freundii in HBMEC, i microfilamenti di actina siano necessari per la segnalazione citosolica e/o la penetrazione batterica alla membrana plasmatica, e i microtubuli possano essere necessari per il trasporto dei batteri legati alla membrana dalla membrana plasmatica verso il lato basolaterale (o appena più in profondità nella cellula). Quindi, un’interruzione in una delle due fasi dell’invasione provocherebbe un “ingorgo”.
In sintesi, i risultati qui presentati indicano che C. freundii può invadere, moltiplicarsi e transcitarsi nelle HBMEC in vitro. La determinazione della base genetica di questi fenotipi fornirà una visione significativa della fisiopatologia della Citrobactermeningite e potenzialmente aiuterà a sviluppare nuove strategie terapeutiche e preventive. Inoltre, un’ampia analisi molecolare comparativa di Citrobacter con altri batteri che causano meningite può far luce sulla proprietà unica di Citrobacter di formazione di ascesso cerebrale.