Che cos’è la colorazione immunoistochimica (IHC)?

Immunostaining utilizza anticorpi per rilevare un antigene nelle cellule o nei tessuti. Il vantaggio principale dell’immunocolorazione nell’immunoistochimica (IHC) è la capacità di vedere il bersaglio desiderato in un campione di tessuto mantenendo il contesto spaziale e l’architettura del tessuto.

Colorazione immunoistochimica (IHC): Definizione breve

Tipi di colorazione

Immunostaining può essere eseguito direttamente o indirettamente. La coniugazione dei nostri anticorpi convalidati per l’applicazione con un certo numero di fluorofori permette l’etichettatura diretta. Per sfogliare la nostra offerta di coniugati diretti, clicca qui.

Spesso in base ai livelli di espressione dell’antigene e accessibilità, un coniugato diretto non è sufficiente per visualizzare il bersaglio di interesse. In questi casi, l’etichettatura indiretta è impiegata utilizzando un anticorpo secondario. Il metodo preferito al CST è quello di utilizzare reagenti di rilevamento altamente sensibili, a una fase, basati su polimeri, specifici per le IgG di coniglio o di topo.

Esempi di colorazione IHC

Di seguito sono riportati alcuni esempi di colorazione IHC eseguita al CST. Ognuno degli anticorpi utilizzati di seguito è stato sottoposto al nostro rigoroso processo di validazione al fine di valutare con fiducia la rilevazione specifica dell’antigene desiderato.

Come si effettua la colorazione immunoistochimica (IHC)?

Preparazione del tessuto

Le procedure di raccolta, conservazione e fissazione del tessuto variano a seconda del campione o del target di interesse. La raccolta e la fissazione del tessuto influenzano direttamente l’integrità del campione e i tuoi risultati sperimentali.

I fissativi a legame incrociato, come la formalina, sono spesso usati per preparare i campioni per IHC perché preservano l’integrità strutturale del tessuto, che aiuta a mantenere l’architettura del tessuto. Un’altra opzione è quella di crioconservare (congelare) i tuoi campioni, che può essere un’opzione migliore se stai cercando di rilevare un bersaglio fosforilato.

Recupero dell’antigene (epitopo)

I fissativi usati per preservare l’integrità strutturale del campione di tessuto hanno anche degli svantaggi in quanto possono seppellire l’epitopo che il tuo anticorpo è progettato per riconoscere.

Esistono diversi metodi per rivelare gli epitopi che sono stati mascherati dalla fissazione. Questi includono il recupero dell’antigene indotto dalla proteolisi, che si basa su un enzima come la proteinasi K, o il recupero dell’epitopo indotto dal calore (HIER), che usa il calore per rompere i legami incrociati e srotolare le proteine. Entrambi i metodi possono smascherare gli epitopi, rendendoli accessibili all’anticorpo primario e adatti alla colorazione IHC.

Al CST, il nostro metodo di recupero dell’antigene più comune è HIER. Tuttavia, i nostri scienziati testano più metodi di recupero dell’antigene per determinare le condizioni ottimali per l’uso di ogni anticorpo in IHC. Il protocollo raccomandato da CST può essere trovato sulla scheda tecnica di ogni anticorpo convalidato per IHC.

Binding anticorpo

Selezionare il giusto anticorpo è uno dei passi più critici per ottenere un risultato IHC di successo. Tutti gli anticorpi convalidati IHC di CST sono verificati non solo come aventi un forte segnale nel tessuto, ma sono sottoposti a una rigorosa procedura di convalida per confermare la specificità del segnale. I nostri scienziati, specializzati in IHC, testano un gran numero di anticorpi e raccomandano solo quelli più adatti all’applicazione.

Clicca qui per sfogliare gli anticorpi validati IHC per il tuo target.

Sistemi di rilevazione

La colorazione immunoistochimica (IHC) permette 2 ampie classi di rilevazione: 1) cromogenico e 2) fluorescente. Per la rilevazione cromogenica, CST raccomanda di utilizzare sistemi basati su polimeri che evitano le limitazioni del sistema basato sulla biotina, aumentando nel contempo la sensibilità del test.

Provare SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, coniglio) #8114 o SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, topo) #8125 a seconda della specie ospite del vostro anticorpo primario. Analisi IHC di carcinoma polmonare umano inserito in paraffina utilizzando Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 e rilevamento basato sulla biotina (a sinistra) o sul polimero (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; a destra). Come mostrato, la rilevazione basata sui polimeri offre una maggiore sensibilità e risulta in una colorazione più robusta.

Counterstaining

Dopo il rilevamento degli anticorpi, molti ricercatori preferiscono controcolorare il tessuto per visualizzare l’anatomia cellulare e orientare l’osservatore rispetto alla colorazione specifica. Al CST, controcoloriamo i nostri campioni usando l’ematossilina #14166, che colora il nucleo di blu. Quando si sceglie una colorazione di contrasto, è importante che questa sia compatibile con il cromogeno. Per esempio, se il colore della controcolorazione è troppo simile al colore del cromogeno, il segnale dell’anticorpo sarà difficile da riconoscere.

Protocollo di colorazione immunoistochimica (IHC)

Di seguito è riportata una panoramica del nostro protocollo consigliato ed evidenziati i passaggi chiave per un esperimento di successo. CST mira ad aiutarti a migliorare la tua analisi IHC fornendo anticorpi e reagenti convalidati per permetterti di seguire un protocollo semplice e specifico per il prodotto e ottenere risultati riproducibili con la minima ottimizzazione richiesta.

Guarda il video del protocollo IHC o visita la nostra pagina di selezione del protocollo.