Back to Basics – What is an Immunoassay – Downloadable PDF Version
What is an immunoassay or ELISA?
Immunoassays are quick and accurate tests that can be used on-site and in the laboratory to detect specific molecules. I test immunologici si basano sulla capacità intrinseca di un anticorpo di legarsi alla struttura specifica di una molecola. Gli anticorpi sono proteine generate dagli animali in risposta all’invasione di una molecola estranea (antigene) nel corpo. Gli anticorpi si trovano nel sangue e nei fluidi tissutali e si legano all’antigene ogni volta che lo incontrano. Poiché gli anticorpi sono sviluppati per la specifica struttura tridimensionale di un antigene, o analita, sono altamente specifici e si legheranno solo a quella struttura. Una volta purificati dal sangue, gli anticorpi monoclonali e policlonali sono reagenti ideali per rilevare e monitorare specifiche molecole target con interferenze limitate da altre sostanze. Quattro formati tipici di ELISA sono: immunodosaggio a sandwich di anticorpi, immunodosaggio antigenico, test di inibizione competitiva e test rapidi.
Immunodosaggio a sandwich di anticorpi
In un tipico immunodosaggio a sandwich di anticorpi, un anticorpo monoclonale viene adsorbito su una piastra di plastica per microtitolazione. Quando il campione viene aggiunto alla piastra, l’anticorpo sulla piastra legherà l’antigene target del campione e lo tratterrà nella piastra. Quando un anticorpo policlonale viene aggiunto nella fase successiva, si lega anche all’antigene bersaglio (già legato all’anticorpo monoclonale sulla piastra), formando così un “sandwich” di antigene tra i due diversi anticorpi.
– Fase 1: Gli anticorpi monoclonali sono adsorbiti sul pozzetto di una piastra di plastica per microtitolazione con un tampone di rivestimento (senza aggiunta di campione).
– Fase 2: Aggiunta di un campione (come il sangue umano, diluito in modo appropriato) al pozzetto della piastra per microtitolazione. L’antigene target si lega all’anticorpo adsorbito sulla piastra, trattenendo l’antigene nel pozzetto.
– Fase 3: legame di un anticorpo policlonale coniugato con un enzima all’antigene target (legato all’anticorpo monoclonale sulla piastra), formando così un ‘sandwich’ di antigene tra i due diversi anticorpi.
– Fase 4: L’aggiunta di un substrato colorimetrico per la rilevazione degli anticorpi policlonali coniugati all’enzima genererà un segnale di colore proporzionale alla quantità di antigene target presente nel campione originale aggiunto alla piastra.
Antigen-Down (Immunity Test) Immunoassay
In un antigen-down (immununity test) immunoassay, l’analita è rivestito utilizzato per legare gli anticorpi presenti in un campione. Quando viene aggiunto il campione (come il siero umano), l’antigene sulla piastra viene legato dagli anticorpi (IgE per esempio) del campione, che vengono poi trattenuti nel pozzetto. Successivamente viene aggiunto un anticorpo specie-specifico (ad esempio anti IgE umane) marcato con HRP, che si lega all’anticorpo legato all’antigene sulla piastra. Maggiore è il segnale, maggiore è la quantità di anticorpi presenti nel campione. I saggi Antigen-down (test di immunità) possono essere configurati come test rapidi e sono spesso usati per diagnosticare condizioni di allergia – di solito il sangue di un paziente viene testato contro diversi allergeni per vedere se la persona ha anticorpi contro quell’allergene.
Immunosaggio a inibizione competitiva
In aggiunta al formato Sandwich anticorpo monoclonale-policlonale (Mo-Po), molti saggi immunologici sono strutturati in un formato a inibizione competitiva. I saggi di inibizione competitiva sono spesso utilizzati per misurare piccoli analiti perché i saggi di inibizione competitiva richiedono solo il legame di un anticorpo piuttosto che due, come nei formati ELISA standard. A causa dell’alta probabilità di ostacolo sterico che si verifica quando due anticorpi tentano di legarsi a una piccola molecola allo stesso tempo, un formato di saggio sandwich non può essere fattibile. Pertanto, un saggio di inibizione competitiva sarebbe preferibile.
In un saggio di inibizione competitiva sequenziale, il campione e l’analita coniugato sono aggiunti in fasi come un saggio sandwich, mentre in un saggio di inibizione competitiva classico, questi reagenti sono incubati insieme allo stesso tempo. In un saggio di inibizione competitiva sequenziale, un anticorpo monoclonale è rivestito su una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Quando il campione viene aggiunto, il MoAb cattura l’analita libero dal campione. Nella fase successiva, viene aggiunta una quantità nota di analita marcato con biotina o HRP. L’analita etichettato cercherà di legarsi al MoAb adsorbito sulla piastra, ma l’analita etichettato è inibito dal legarsi al MoAb dalla presenza dell’analita precedentemente legato dal campione. Ciò significa che l’analita etichettato non sarà legato dal monoclonale sulla piastra se il monoclonale ha già legato l’analita non etichettato dal campione. La quantità di analita senza etichetta nel campione è inversamente proporzionale al segnale generato dall’analita etichettato. Più basso è il segnale, più analita non etichettato c’è nel campione. Una curva standard può essere costruita utilizzando diluizioni seriali di un analita standard non etichettato. I valori dei campioni successivi possono poi essere letti dalla curva standard come si fa nei formati ELISA a sandwich. Il classico formato di test di inibizione competitiva richiede l’aggiunta simultanea di analita marcato (analita coniugato) e non marcato (dal campione). Sia l’analita marcato che quello non marcato competono simultaneamente per il sito di legame dell’anticorpo monoclonale di cattura sulla piastra. Come il formato di inibizione competitiva sequenziale, il segnale colorato è inversamente proporzionale alla concentrazione di analita target non etichettato nel campione. La rilevazione dell’analita marcato può essere fatta usando un substrato di perossidasi come il TMB, che può essere letto su un lettore di piastre per microtitolazione.
Rapido Immunoassay
Oltre alle piastre per microtitolazione, gli immunodosaggi si configurano anche come test rapidi, come un test di gravidanza a domicilio. Come i test su micropiastra, i test rapidi utilizzano anticorpi per reagire con gli antigeni e possono essere sviluppati come formati sandwich MoAb-PoAb, formati di inibizione competitiva e formati antigen-down. Con un test rapido, i reagenti anticorpo e antigene sono legati a membrane porose, che reagiscono con campioni positivi mentre incanalano i fluidi in eccesso verso una parte non reattiva della membrana. I test immunologici rapidi sono comunemente disponibili in 2 configurazioni: un test a flusso laterale in cui il campione viene semplicemente messo in un pozzetto e i risultati vengono letti immediatamente; e un sistema a flusso continuo, che richiede di mettere il campione in un pozzetto, lavare il pozzetto, e poi finalmente aggiungere un coniugato di oro analitico eolloidale e il risultato viene letto dopo pochi minuti. Viene testato un campione per striscia o cassetta. Poiché i test rapidi sono più veloci dei saggi su piastra di microtitolazione, richiedono un’elaborazione minima del campione, sono spesso più economici e generano risposte sì/no senza utilizzare uno strumento, sono spesso utilizzati sul campo da persone non di laboratorio che analizzano campioni interi. Tuttavia, i test immunologici rapidi non sono così sensibili e non possono essere utilizzati per quantificare accuratamente un analita (l’automonitoraggio dei livelli di glucosio nel sangue da parte dei diabetici è considerato un test rapido quantitativo, tuttavia, la tecnologia immunologica non viene utilizzata per questi test). Tutti i test immunologici rapidi possono essere convertiti in un test su micropiastra, ma non tutti i test su micropiastra possono essere convertiti in un test rapido.
