Nukleotidok és nukleozidok integrált szintézise aminosavakkal befolyásolva

Glikozilációs termékek egyidejű képzése

Nukleozid és nukleotid szerkezetek képzése egyszerű prekurzorokból egyszerre három nukleobázissal dehidratációs reakciókkal sikerült. Ez ellentétben áll az e területen végzett korábbi munkákkal, ahol a körülményeket úgy optimalizálták, hogy azok specifikus termékeknek kedvezzenek24,25,26. Egy tipikus glikozilációs kísérletben az adenint és a P-ribózt 90 °C-on melegítettük 5 órán keresztül pH 2,5 mellett. Megfigyeltük az adenin-monofoszfát (AMP) nukleotid (és izomerjei) képződését, amikor adenin és P-ribóz egyesült. A termékek HPLC-MS-analíziséből kapott extrahált ionkromatogramok (EIC) több, a + és + m/z-nek megfelelő csúcsot mutattak (13-15. kiegészítő ábra). A standardokkal való összehasonlítás megerősítette, hogy az AMP megfelel az RT = 4,2 percnél talált csúcsnak (5., 6. kiegészítő ábra); a többi nagyobb csúcs az AMP izomerekkel, például az N6-ribozilált izomerrel lehet összhangban. Ennek megerősítése érdekében NaOH (0,1 M) jelenlétében hidrolízisreakciót végeztünk, hogy megpróbáljuk megkülönböztetni a különböző izomereket, figyelembe véve, hogy az N6-ribozilált izomer hajlamosabb a hidrolízisre. A csúcsokban azonban enyhe zavar figyelhető meg, ami megnehezíti az N6-ribozilált izomer azonosságának megerősítését. Ezt követően két különböző izomer (adenozin-3′-monofoszfát és adenozin-5′-monofoszfát-monohidrát) két tiszta standardját elemeztük külön-külön és keverékben, hogy tisztázzuk az izomerek elúciós profilját (148., 149. kiegészítő ábra). A standard keverék esetében megfigyelhető a retenciós idő eltolódása, ami jobb korrelációt biztosít e vegyületek elúciójával a valós mintában. Bár nehéz különbséget tenni az izomerek között, a standard keverék elúciós profiljának a valós mintával való összehasonlításával megerősíthetjük legalább két izomer jelenlétét az AMP termékeken belül. Most már világos, hogy a különböző izomerek kialakulása (12. kiegészítő ábra) az azonos tömegű nukleotidok különböző retenciós idővel történő eluálásának egyik lehetséges oka. Továbbá a reakciótermékeink MS/MS-elemzése az AMP (és izomerjei) adeninre (m/z = 136,0617 ± 0,01) fragmentálódását mutatja (20. kiegészítő ábra); ez összhangban van a kanonikus AMP-standard fragmentációjával. Az általunk javasolt reakciómechanizmus a ribóz 1′-OH csoportja és az adenin aminocsoportja közötti glikozidos kötés kialakulásából áll (lásd a 12. kiegészítő ábrát).

Az időbeli reakciók azt mutatják, hogy a vízpárolgás a glikozilációs termékek képződésének fő hajtóereje, ami a nukleozid és nukleotid szerkezetek képződésének jelentős növekedését mutatja a 2 és 4 óra közötti időszakban (2a. ábra). Ez megfelel annak az időtartománynak, amikor a minta térfogata drasztikusan csökken, és a reagensek rendkívül koncentráltak. Az 5-6 órás reakció után a minta eléri a szárazságot, és a reakció sebessége (amelyet a HPLC-MS mérésekben az intenzitás követ) stabilizálódik. Az AMP mellett glikozidos kötést tartalmazó termékeket, köztük ciklikus nukleotidokat (pl. cAMP)27 és nukleozidokat (pl. adenozin) is kimutattunk RP-HPLC-MS, MS/MS segítségével, és vizsgáltuk az 1,N6-etén-származék képződését28,29 , amit a standardokkal való összehasonlítással megerősítettünk (2. ábra, 7-11. kiegészítő ábra, 23-27. kiegészítő ábra). A 2′,3′-cAMP és a 3′,5′-cAMP kanonikus standardok retenciós ideje nem egyezett a mintában lévő EIC-csúcsok retenciós idejével. A tömegeloszlások (+; +) és a fragmentációs mintázatok (+) azonban megegyeztek (16-21. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy bár ciklikus szerkezetek képződnek, nem a kanonikus cAMP a fő termék. Az adenozin analitikai standarddal való összehasonlítás azt is mutatja, hogy a P-ribóz és adenin kondenzációs reakciójában számos izomer speciesszel együtt adenozin keletkezik (18-22. kiegészítő ábra). Bár az AMP és az adenozin kanonikus formáit igazolták ezekben a kísérletekben, a dehidratációs reakcióban nem ezek voltak a fő termékek.

Ha a foszfátot külön pirofoszfátként adagoltuk, és adeninnel és ribózzal reagáltattuk, egy adenozin tömegű vegyületet detektáltunk, valamint kis mennyiségű AMP-t és cAMP-ot, és adenozin akkor is képződött, ha nem volt jelen foszfátforrás (33-41. kiegészítő ábra). Érdemes megjegyezni, hogy vizsgálatainkat szándékosan a foszforilált termékek (AMP-izomerek és cAMP-izomerek) azonosítására összpontosítottuk, és kevesebb figyelmet fordítottunk olyan foszforilált termékek azonosítására, amelyek nem AMP-izomerek és cAMP-izomerek30,31,32. Javaslatunk szerint a ribóz hidroxilcsoportja és az adenin aminocsoportja között glikozidos kötés jön létre, amelyet egy vízmolekula párolgás általi elvesztése vált ki. Az adenin primer és szekunder amincsoportjainak relatív reakcióképességét jól tanulmányozták33 , és aktiválás vagy védőcsoport jelenléte nélkül a glikozidos kötés az elsődleges aminon általában előnyben részesül. Ezért az adenozin/AMP kanonikus izomerje várhatóan nem lesz fő termék, mivel ahhoz kizárólag a másodlagos aminon kellene reagálni. A reakcióképesség azonban a másodlagos amin helyén elég nagy ahhoz, hogy a kanonikus izomerek képződjenek, bár nem főtermékként. Más nukleobázisokban, mint például a guaninban, még több hozzáférhető amincsoport van, és az izomer termékek lehetősége nagyobb. A ribóz reakcióképessége valószínűleg túlnyomórészt az anomer helyzetén keresztül történik, ami kevesebb lehetséges izomerhez vezet, bár néhány egyéb kisebb termék is megfigyelhető.

Más kanonikus nukleobázisok (citozin, guanin és timin) P-ribózzal való reakcióképességét is vizsgálták. A guanin és citozin P-ribózzal történő dehidratálási reakcióját követően nukleozid és nukleotid szerkezeteknek megfelelő tömegeket detektáltunk (3. ábra és 50-64. kiegészítő ábra). A guanin glikozilációs struktúrák viszonylag kis mértékben képződtek, valószínűleg a guanin alacsony pH-n való korlátozott oldhatósága miatt. Az 5-metiluridin-monofoszfát (m5UMP) és az 5-metiluridin (timinnukleozid) esetében mért termékmennyiségek még alacsonyabbak voltak, mint a guaninból és citozinból származó megfelelőik (3. ábra és 65., 66. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azzal magyarázhatók, hogy a guaninban és a citozinban van egy elsődleges aminocsoport, amely a timinből hiányzik. Bár mindhárom nukleobázis rendelkezik másodlagos amincsoporttal, ezek kevésbé reaktívak a glikozidos kötésképzésben. Ezért a nukleozid- és nukleotidszerkezetek másodlagos aminreakcióval történő kialakulása, ahogyan az a kanonikus glikozilációs termékek kialakulásához szükséges, kedvezőtlen az olyan nukleobázisokban, ahol primer aminok állnak rendelkezésre. Ennek érdekes következménye van a nukleinsavak kémiájának az élet keletkezése során történő elfogadására, mivel azt sugallja, hogy a kanonikus nukleotidok kezdetben alkalmatlanok lehettek, amíg további biokémiai gépezetek nem alakultak ki a megfelelő izomerekkel szembeni szelektivitás fokozására. Ezért a várakozásoknak megfelelően, miközben a citozin és a guanin kanonikus nukleotid- és nukleozidtermékei képződtek a kísérleteinkben, ezek nem feleltek meg a megfigyelt fő csúcsoknak (42-49. kiegészítő ábra). E két megfigyelés (eltérő retenciós idők, de a kanonikus standardokkal azonos tömegeloszlás az EIC-kben) kombinálásával arra következtethetünk, hogy a guanin/citozin P-ribózzal történő dehidratációs reakciójából képződött nukleotid- és nukleozidfajok főként a kanonikus nukleotidok és nukleozidok izomerjei voltak (néhány lehetséges szerkezetet a Kiegészítő ábrák mutatnak. 50, 51).

A nukleotidszerkezetek kialakítását tipikusan a felhasznált nukleobáztól függően meghatározott körülmények között, egy adott reakcióterméket megcélozva végeztük. Egy alternatív megközelítésben úgy döntöttünk, hogy egyszerre több nukleobázist vonunk be a P-ribózzal való reakcióba. Célunk az volt, hogy meghatározzuk, hogy több nukleobázissal azonos reakciókörülmények között a termékképződés a termékek keverékét eredményezi-e, vagy egy dominál. Ezt a reakciót úgy hajtottuk végre, hogy két vagy három nukleobázt (adenin, guanin és citozin) egyszerre vittünk be a reakcióedénybe, a P-ribózzal együtt. A glikozilációs termékek keverékét kaptuk, amely nukleotidokat (AMP, GMP és CMP), valamint a megfelelő ciklikus nukleotid (cAMP, cGMP és cCMP) és nukleozid termékeket (adenozin, guanozin és citidin) tartalmazott (67-95. kiegészítő ábra). A guanin glikozilációs termékek kisebb hozammal képződtek, mint az adenin és a citozin, ahogy az várható volt a guanin alacsony oldhatósága miatt savas körülmények között.

Nukleobáziscsere

Nukleobáziscserét figyeltünk meg, amikor Na+AMP-ot 5 órán keresztül 90 °C-on melegítettük savas vizes közegben citozinnal vagy guaninnal. A nukleobáziscsere nukleotid (CMP vagy GMP), ciklikus nukleotid (cCMP vagy cGMP) és nukleozid (citidin vagy guanozin) szerkezetek kialakulását eredményezte (lásd a 96-102. kiegészítő ábrákat és az 1. kiegészítő táblázatot a félkvantitatív hozamokról). Ebben a kísérletben a CMP és a citidin intenzitása növekvő tendenciát mutatott, míg a cCMP maximális intenzitást ért el, amikor 12,5 mM volt, majd 4,0 × 104 AU intenzitásig csökkent (102a. és 155-158. kiegészítő ábra). 37,5 mM citozinkoncentrációnál a nagyobb intenzitású vegyületnek a CMP-t találtuk, és a cCMP és a citidin esetében mért intenzitások közel azonosak voltak. A CMP és a cCMP EIC-jeiben két fő izomer faj volt megfigyelhető. A CMP esetében +, + és + tömegeket észleltünk, míg a cCMP esetében +, + és + tömegeket mutattunk ki a saját tömegeloszlásukon belül. A citidin esetében a + volt a fő detektált csúcs. Ezek a tömegeloszlások megegyeztek a standardoknál megfigyeltekkel. A fő izomerek retenciós ideje azonban nem felelt meg a kanonikus CMP-nek és citidinnek. Amikor az AMP-t növekvő guanin koncentrációval reagáltattuk (102b. kiegészítő ábra), mindhárom glikozilációs termék (GMP, cGMP és guanozin) maximális értéket ért el, amikor a guanin koncentrációja 2,5 mM volt (160-162. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények a guanin korlátozott oldhatóságának következményei voltak savas pH-n, így hiába adtunk több guanint a reakcióedénybe, az oldatban a tényleges koncentráció nem változott. A maximális értéket követően a cGMP és a guanozin intenzitása a guanin gyenge oldhatósága miatt állandó volt. Mindhárom guanin glikozilációs termék intenzitásának csak kis mértékű növekedését figyeltük meg, amikor = 37,5 mM volt, ami összefügghet azzal, hogy a hozzáadott magas koncentráció miatt a guanin nagyobb mértékben volt jelen az oldatban. A GMP EIC-jénél egy széles, jól meghatározott csúcsok nélküli területet figyeltünk meg, bár két fő csúcs emelkedett ki. Az EIC tömegeloszlásában a + volt az egyetlen kémiai faj, amely a guaninvegyületekhez kapcsolódott. Négy, párban csoportosuló csúcsot figyeltünk meg, amikor a cGMP EIC-jét kivontuk az MS-adatokból, és a tömegeloszlás + és + fajokat mutatott. Ezzel szemben a guanozin EIC-je három csúcsot mutatott, amelyek közül a legintenzívebb a + jelenlétét mutatta a tömegeloszlásában.

A citozin és guanin glikozilációs termékek képződése azt mutatta, hogy az AMP glikozidos kötés hasadása a mi reakciókörülményeink között történt. Amikor az AMP, a cAMP és az adenozin EIC-jét elemeztük, minden kromatogramon több csúcsot figyeltünk meg, ami alátámasztja azt az elméletet, hogy a glikozidos kötések dinamikus hidrolízisnek/képződésnek mennek keresztül a dehidratálási reakció során34. A citozin és guanin nukleotidok adeninnel való reakcióit is vizsgálták. A CMP és az adenin dehidratációs reakciója esetében nem volt megfigyelhető nukleobáziscserének megfelelő termék (103-108/a. kiegészítő ábra). A GMP és adenin reakciójában azonban egyértelműen kimutathatók voltak adenin glikozilációs termékek (Kiegészítő ábrák 105-108/b). Ennek az az oka, hogy a GMP-ben a glikozidos kötések hidrolízise azonos reakciókörülmények között könnyebben megy végbe, mint a CMP esetében34. A nukleobáziscsere-reakciót UMP-vel és adeninnel is elvégeztük, hogy összehasonlítsuk az adenin közvetlen pirimidin analógjával (109. kiegészítő ábra). Az eredmények jobban hasonlítottak a 108. kiegészítő ábrán bemutatott CMP-hozamokhoz, mint a GMP-hozamokhoz, az UMP-reakcióban az adenin glikozilációs termékek nagyon alacsony hozamát kaptuk, ami nem elegendő az AMP és a cAMP kimutatásához.

Aminosavak hatása a glikozilációs termékek eloszlására

Amint korábban említettük, az aminosavak, nukleotidok és építőköveik egyidejűleg lehettek jelen a korai Földön. Ezért egy ko-polimerizációs reakció termékei, vagy akár az egyik polimertípusnak a másikra gyakorolt valamilyen katalitikus hatásából származó termékek is keletkezhettek prebiotikus környezetben. A nukleotid-építőelemek és az aminosavak egytényezős dehidratációban való együttes reakciójának tanulmányozására a glicint, a legegyszerűbb aminosavat bevonták a P-ribóz és a megfelelő nukleobázisok dehidratációs reakcióiba. A glicin beépítése egyértelmű hatással volt a glikozilációs termékek képződésére, ami az AMP-izomerek, a cAMP-izomerek és az adenozin tömegével rendelkező termékek (4a. ábra és 28-32. kiegészítő ábra) összhozamának csökkenését okozta. Ez arra utal, hogy a glicin vagy a nukleotid-építőelemek (P-ribóz és/vagy adenin) mellékreakció révén történő elfogyasztásában játszik szerepet, vagy pedig a termékszerkezethez kötődik, megváltoztatva annak tömegét. E reakciók EIC-elemzése a glicin adduktok (azaz AMP-Gly, cAMP-Gly, adenozin-Gly és adenin-Gly) tömegének megfelelő csúcsokat mutat (115-122. kiegészítő ábra), bár ezek a melléktermékek nem képződnek elegendő mennyiségben ahhoz, hogy az összes megfigyelt változásért felelősek legyenek. A glicin adduktokat úgy is megerősítették, hogy deuterált glicint használtak kiindulási anyagként P-ribózzal és adeninnel együtt, ami változásokat okozott az addukt tömegének izotópos eloszlásában (123., 124. kiegészítő ábra). A P-ribóz és adenin reakciójában a glikozilációs termékek (AMP-izomerek, ciklikus AMP-izomerek és adenozin) képződésénél 59%-os maximális félkvantitatív hozamot kaptunk, azonban csak 46%-os hozamot értünk el, ha a reakcióközegben glicin is jelen volt (144. kiegészítő ábra). Az összes lehetséges egyedi izomer hozamának számszerűsítése technikailag nehéz, de néhány izomer félkvantitatív hozamát tiszta standardok segítségével meg lehetett határozni: Az adenozin-5′-monofoszfát és az adenozin-2′,3′-ciklikus monofoszfát 38,7%-os, illetve 18,2%-os hozamot mutatott glicin hiányában, míg glicin jelenlétében a hozam mindkét izomer esetében jelentősen csökkent (<2%).

A glicin az izomer fajok eloszlását is befolyásolta, és egyértelmű különbségeket figyeltünk meg a P-ribóz és adenin reakciójából származó alapcsúcs-kromatogramhoz (BPC) képest glicin jelenlétében és hiányában (4b. ábra és 110-114. kiegészítő ábra). Ezek az adatok különböző kémiai speciesek jelenlétére és az ebből eredő tömegeloszlás változására utaltak a glicinnel és a glicin nélkül végzett reakciók között. Ezután minden egyes adenin-glikozilációs termékre egyedi EIC-eket elemeztünk, aminek eredményeképpen egyértelmű különbségeket figyeltünk meg a csúcsok relatív intenzitásában, amikor glicint adtunk hozzá. Ezek az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a glicin szelektív hatással van arra, hogy melyik izomer faj képződik előnyben. A glicinről ismert, hogy dehidratáló körülmények között könnyen reagál más aminokkal12 , és valószínűleg reagál a nukleobázisok primer aminjaival is. A glicint is tartalmazó hibrid melléktermékeket (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenozin, Gly-Adenin) ~1%-os hozammal detektáltuk (145. kiegészítő ábra), ez a kis százalékos arány azonban fontos hatással van az adenin glikozilációs termékek izomereloszlására (lásd a 146., 147. kiegészítő ábrákat). A hibrid termékek tömegének izotópos eloszlásában változást észleltünk (123., 124. kiegészítő ábra), amikor deuterált glicint vontunk be a dehidratálási reakcióba, ami megerősíti a glicin beépülését a hibrid szerkezetekbe.

Az izomereloszlásra gyakorolt hasonló hatást figyeltünk meg akkor is, amikor a P-ribózt citozin/guaninnal reagáltattuk glicin jelenlétében (4c. ábra, 125-140. kiegészítő ábra). A különböző izomerfajok (GMP, CMP, cGMP, cCMP, cCMP, guanozin és citidin) maximális intenzitásai csökkentek, miközben a relatív intenzitások eloszlása is megváltozott. A kísérletek közötti különbségeket szigorúan ellenőriztük egy olyan statisztikai módszerrel, mint az EIC-adatok klaszterelemzése, hogy a mintákat glicin jelenlétében és hiányában közös jellemzőkkel rendelkező alkotócsoportokra/klaszterekre szegmentáljuk (5. ábra). A klaszterelemzés célja ebben a vizsgálatban az adatok (pl. nukleotid- és nukleozidszerkezet-képződés) csoportosítása közös jellemzőkkel rendelkező alkotócsoportokba (pl. glicin hozzáadása versus glicin nélkül). Ennek az elemzésnek nagy belső homogenitást kell mutatnia a klasztereken/csoportokon belül és nagy külső heterogenitást a klaszterek/csoportok között. Az 5. ábra egy dendrogramot mutat be “Wards” összekapcsolással35. A klaszterek azonosításához a dendrogramban a spektrumokat a glicin jelenléte szerint színeztük (glicin – piros, glicin nélkül – fekete, üres – kék). Mint megfigyelhető, a glicint tartalmazó minták csoportosulnak. Egy klaszter megfelel a P-ribóz + adenin + glicin (három minta), amely elkülönül a glicin nélküli mintáktól. Egy másik klaszter a P-ribóz + guanin + glicin és a P-ribóz + citozin + glicin csoportoknak felel meg. Az adenint tartalmazó minták egy nagyobb klaszterbe különülnek el, amely elkülönül a többi mintától, ami az adenin erős befolyását jelzi a reakcióban. Valójában számos más lehetséges termék és reakció is lejátszódhat az elvégzett reakciókörülmények között (további részletekért lásd az 1. kiegészítő megjegyzést és a 150-162. kiegészítő ábrákat).

Az adenin P-ribózzal történő dehidratálási reakciójába más aminosavakat is bevontunk, hogy megvizsgáljuk, van-e ezeknek is valamilyen hatásuk a glikozilációs termékek izomereloszlására (141-143. kiegészítő ábra). Az e vizsgálathoz kiválasztott hat aminosav (arginin, glutaminsav, treonin, metionin, fenilalanin és triptofán) különböző kémiai természetű és funkciós csoportú oldalláncokkal rendelkezik. Amikor az eredményeket összehasonlítottuk a csak P-ribóz és adenin reakciójából kapott adatokkal, az AMP izomereloszlásának változását figyeltük meg minden reakcióban, kivéve a triptofán esetében, ami a triptofán indol alapú oldalláncának jelenléte miatti konformációs korlátoknak tulajdonítható. A cAMP EIC-eket elemezve kisebb változásokat észleltünk az izomer csúcsok relatív intenzitásában. Az adenozin EIC-ben azonban csak a fenilalanint és treonint is tartalmazó reakciók esetében figyeltek meg egyértelmű különbséget.