Az immunfestés antitesteket használ egy antigén kimutatására sejtekben vagy szövetekben. Az immunfestés fő előnye az immunhisztokémiában (IHC) az, hogy a szövetmintában láthatóvá válik a kívánt célpont a térbeli kontextus és a szöveti architektúra megőrzése mellett.
Immunhisztokémiai (IHC) festés:
A festés típusai
Az immunfestés történhet közvetlenül vagy közvetve. Alkalmazásilag validált antitestjeink konjugálása számos fluorofórral lehetővé teszi a közvetlen jelölést. A közvetlen konjugátumok kínálatának böngészéséhez kattintson ide.
Az antigén expressziós szintje és hozzáférhetősége alapján a közvetlen konjugátum gyakran nem elegendő az érdeklődésre számot tartó célpont láthatóvá tételéhez. Ezekben az esetekben indirekt jelölést alkalmaznak másodlagos antitest használatával. A CST-nél előnyben részesített módszer a nyúl vagy egér IgG-re specifikus, nagy érzékenységű, egylépéses, polimer alapú detektáló reagensek használata.
Példák IHC festésre
A CST-nél végzett IHC festések néhány példája az alábbiakban látható. Az alább használt antitestek mindegyike átesett a szigorú validálási folyamatunkon, hogy magabiztosan értékelhessük a kívánt antigén specifikus kimutatását.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Paraffinba ágyazott humán tüdőrák IHC-elemzése PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb használatával.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Paraffinba ágyazott humán tüdőrák IHC-elemzése PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb használatával.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326 használatával paraffinba ágyazott humán emlőrák IHC elemzése: CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb használatával paraffinba ágyazott humán emlőrák IHC elemzése.
α-Sima izomaktin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Leica® Bond™ Rx készülékkel végzett IHC-elemzés paraffinba ágyazott humán endometrioid karcinóma α-Sima izomaktin (D4K9N) XP® Rabbit mAb használatával.
α-Sima izomaktin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Paraffinba ágyazott humán endometrioid karcinóma IHC-elemzése α-Sima izomaktin (D4K9N) XP® Rabbit mAb használatával Leica® Bond™ Rx készülékkel elvégezve.
Hogyan történik az immunhisztokémiai (IHC) festés?
Szövetelőkészítés
A szövetgyűjtési, konzerválási és fixálási eljárások a mintától vagy az érdeklődés célpontjától függően változnak. A szövet gyűjtése és rögzítése közvetlenül befolyásolja a minta integritását és az Ön kísérleti eredményeit.
A keresztkötésű fixálószereket, mint például a formalin, gyakran használják a minták IHC-hez való előkészítéséhez, mivel megőrzik a szövet szerkezeti integritását, ami segít megőrizni a szöveti architektúrát. Egy másik lehetőség a minták krioprezerválása (lefagyasztása), ami jobb megoldás lehet, ha foszforilált célpontot próbál detektálni.
Az antigén (epitóp) visszanyerése
A szövetminta szerkezeti integritásának megőrzésére használt fixálószereknek is van hátránya, mivel eltemethetik az epitópot, amelynek felismerésére az antitestet tervezték.
A fixálással elfedett epitópok feltárására több módszer is létezik. Ezek közé tartozik a proteolitikus indukált antigén-visszakeresés, amely egy olyan enzimre támaszkodik, mint a proteináz K, vagy a hőindukált epitóp-visszakeresés (HIER), amely hőt használ a keresztkötések felbontására és a fehérjék feloldására. Mindkét módszer képes leleplezni az epitópokat, hozzáférhetővé téve azokat az elsődleges antitest számára, és IHC-festésre alkalmassá téve őket.
A CST-nél a leggyakoribb antigén-visszanyerési módszerünk a HIER. Tudósaink azonban többféle antigén-visszanyerési módszert tesztelnek, hogy meghatározzák az egyes antitestek IHC-ben való felhasználásának optimális feltételeit. A CST által ajánlott protokoll megtalálható minden IHC-validált antitest adatlapján.
Az antitest kötődése
A megfelelő antitest kiválasztása az egyik legkritikusabb lépés a sikeres IHC eredmény eléréséhez. A CST minden IHC-validált antitestje nemcsak erős jelet mutat a szövetekben, hanem szigorú validálási eljáráson is átesik a jel specifitásának megerősítése érdekében. Az IHC-re specializálódott tudósaink nagyszámú antitestet tesztelnek, és csak azokat ajánlják, amelyek a legjobban megfelelnek az adott alkalmazáshoz.
Kattintson ide a célpontjához tartozó IHC-validált antitestek böngészéséhez.
Kimutatási rendszerek
Az immunhisztokémiai (IHC) festés a kimutatás 2 széles osztályát teszi lehetővé: 1) kromogén és 2) fluoreszcens. A kromogén detektáláshoz a CST a polimer alapú rendszerek használatát ajánlja, amelyek elkerülik a biotin alapú rendszer korlátait, ugyanakkor növelik a vizsgálat érzékenységét.
Próbálja ki a SignalStain® Boost IHC detektáló reagenst (HRP, nyúl) #8114 vagy a SignalStain® Boost IHC detektáló reagenst (HRP, egér) #8125 az elsődleges antitest gazdafajától függően.
A polimer alapú detektálás érzékenyebb, mint a biotin alapú rendszerek. Paraffinba ágyazott humán tüdőrák IHC-elemzése Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 és vagy biotin alapú (balra) vagy polimer alapú (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; jobbra) detektálással. Amint látható, a polimer alapú detektálás nagyobb érzékenységet biztosít és robusztusabb festést eredményez.
A polimer alapú detektálás érzékenyebb, mint a biotin alapú rendszerek. Paraffinba ágyazott humán tüdőrák IHC-elemzése Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 és biotin alapú (balra) vagy polimer alapú (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; jobbra) detektálással. Amint látható, a polimer alapú detektálás nagyobb érzékenységet biztosít és robusztusabb festést eredményez.
Nem minden DAB-szubsztrát teljesít egyformán. Paraffinba ágyazott humán emlőrák IHC-elemzése a Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 használatával. A kromogén kimutatás a SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (balra), a versenytárs 1 által szállított DAB (középen) vagy a versenytárs 2 által szállított DAB (jobbra) használatával történt. Bár a versenytárs 2 DAB a SignalStain® DAB Substrate Kithez hasonló jelet produkál, a versenytárs 1 DAB sokkal gyengébb jelet eredményez.
Nem minden DAB-szubsztrát egyformán teljesít. Paraffinba ágyazott humán emlőrák IHC-elemzése a Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 használatával. A kromogén kimutatás a SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (balra), a versenytárs 1 által szállított DAB (középen) vagy a versenytárs 2 által szállított DAB (jobbra) használatával történt. Bár a versenytárs 2 DAB a SignalStain® DAB Substrate Kithez hasonló jelet produkál, a versenytárs 1 DAB sokkal gyengébb jelet eredményez.
Kontrafestés
Az antitest-detektálás után sok kutató a szövetek kontrafestését részesíti előnyben, hogy láthatóvá tegye a sejtek anatómiáját és orientálja a nézőt a specifikus festés tekintetében. A CST-nél a mintáinkat a Hematoxylin #14166 ellenfestéssel festjük, amely kékre színezi a sejtmagot. Az ellenfesték kiválasztásakor fontos, hogy az ellenfesték kompatibilis legyen a kromogénnel. Ha például az ellenfesték színe túlságosan hasonlít a kromogén színéhez, az antitest jelét nehéz lesz felismerni.
Immunohisztokémiai (IHC) festési protokoll
Az alábbiakban áttekintjük az általunk ajánlott protokollt, és kiemeljük a sikeres kísérlet legfontosabb lépéseit. A CST célja, hogy validált antitestek és reagensek biztosításával segítse Önt az IHC-elemzés javításában, hogy egyszerű, termékspecifikus protokollt követhessen, és minimális optimalizálási igény mellett reprodukálható eredményeket érhessen el.
Nézze meg az IHC protokoll videóját, vagy látogasson el protokollválasztó oldalunkra.