Escherichia coli metabolikus mérnöki képzése fahéjaldehid előállítására

Enzimek kiválasztása a fahéjaldehid bioszintéziséhez

A fahéjaldehid szintetizálható l-fenilalaninból, és bioszintéziséhez három enzimatikus reakció szükséges: (i) az l-fenilalanin dezaminálása fahéjsavvá a fenilalanin-ammónia-liáz (PAL, EC 4.3.1.24) által, (ii) a fahéjsav sav-tiol ligálása fahéj-CoA-hoz a 4-kumarát:CoA ligáz (4CL, EC 6.2.1.12), és iii) a fahéj-CoA fahéj-CoA redukciója fahéj-CoA reduktáz (CCR, EC 1.2.1.44) által fahéjaldehiddé (1a. ábra) . A PAL egy ubiquitikus enzim, amely számos növényben, gombában és néhány baktériumban megtalálható, és az enzim eredetétől függően különböző aktivitásokat és specifitásokat mutat . Két PAL enzimet vizsgáltunk, egy Arabidopsis thaliana növényből (AtPAL) és egy Streptomyces maritimus baktériumból (SmPAL) származó PAL enzimet, hogy alkalmasak-e fahéjsav előállítására E. coli-ban. Az AtPAL esetében négy izomer létezik, köztük az AtPAL1-től az AtPAL4-ig, és korábban arról számoltak be, hogy legtöbbjük (AtPAL1, 2 és 4) hasonlóan nagyobb aktivitással rendelkezik, mint az AtPAL3 az l-fenilalanin mint szubsztrát esetében, ezért az AtPAL1-et választottuk növényi forrásból származó képviselőnek. Kinetikai állandójuk (Km) 68, illetve 23 μM volt. Mindegyik His-taggal jelölt PAL enzimet E. coli BL21(DE3)-ban állítottuk elő, és a “Módszerek” című fejezetben leírt eljárások szerint tisztítottuk. Mindkét enzimet, az AtPAL1-et (78 kDa) és az SmPAL-t (56 kDa) sikeresen tisztítottuk (Additional file 1: S1 ábra). Bár az AtPAL1 expressziós szintje nem volt olyan magas, hogy az SDS-PAGE 1. és 2. sávjában nem volt látható sáv, az AtPAL1 sávja az affinitási oszlopkromatográfia után egyértelműen látható volt a 3. sávban, amelybe a koncentrált eluátumot töltöttük. Az egyes tisztított PAL enzimek ekvivalens molaritását azonos mennyiségű l-fenilalaninnal (mint szubsztráttal) inkubáltuk, és a fahéjsav termelődési titerét nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) számszerűsítettük (Additional file 2: S2 ábra). Amint az 1b. ábrán látható, az SmPAL szignifikánsan nagyobb aktivitást mutatott (30 °C-os reakció esetén 21-szeres, 37 °C-os reakció esetén 27-szeres), mint az AtPAL1.

Vizsgáltunk két különböző 4CL enzimet is, az egyiket Streptomyces coelicolorból (ScCCL), a másikat A. thalianából (At4CL), hogy alkalmasak-e a fahéjsav fahéjaldehiddé történő átalakítására E. coliban. Az At4CL esetében ismert, hogy 14 feltételezett izoforma létezik (At4CL1-At4CL14) . A 14 izoforma közül az At4CL1-3 hasonló aktivitással rendelkezik a fahéjammal szemben, míg a többi izoforma nem. Ezért az At4CL1-et választottuk reprezentatívnak. Az A. thaliana-ből származó CCR enzimet (AtCCR1) is használtuk a fahéj-CoA fahéjaldehiddé történő átalakítására. Mindegyik 4CL enzimet (At4CL1 és ScCCL ) A. thaliana-ből származó CCR enzimmel (AtCCR) kombinálva vizsgáltuk. Minden enzimet sikeresen, nagy tisztasággal tisztítottunk (Additional file 1: S1 ábra). Az At4CL1 és ScCCL enzimaktivitásának összehasonlításához két reakciót, (i) At4CL1 AtCCR-rel és (ii) ScCCL AtCCR-rel, készítettünk és fahéjsavval mint szubsztráttal kevertük. A 30 és 37 °C-on történő inkubálás után a fahéjaldehid-titert HPLC-vel elemeztük. Amint az 1c. ábrán látható, a ScCCL és az AtCCR kombinációja nagyobb fahéjaldehid-titer termelést eredményezett (4,4-szeres 30 °C-os reakcióban és 10,4-szeres 37 °C-os reakcióban), mint az At4CL1 és az AtCCR kombinációja. Ezen eredmények alapján fahéjaldehid bioszintézis rendszert konstruáltunk E. coli-ban az alábbiakban leírtak szerint a következő enzimek felhasználásával: SmPAL, ScCCL és AtCCR.

Fahéjmaldehid bioszintézis útvonal konstruálása E. coli-ban

A fahéjmaldehid előállításához E. coli-ban az SmPAL, ScCCL és AtCCR géneket a következő sorrendben klónoztuk a pTrc99A-ba: SmPAL, ScCCL és AtCCR (így kaptuk a pHB-CAD gént) (2a. ábra). A pHB-CAD-et hordozó E. coli W3110-et két különböző hőmérsékleten (30 és 37 °C) tenyésztettük, hogy megtaláljuk a fahéjaldehid-termelés optimális hőmérsékletét. Az enzimek expresszióját SDS-PAGE, majd western blot elemzéssel vizsgáltuk a “Módszerek” című fejezetben leírtak szerint. Mindkét hőmérsékleten minden enzim jól expresszálódott és jól oldódott (2b. ábra). Bár az egyes enzimek expressziója eltérő szinten volt, 37 °C-on mindegyik enzim expressziója kismértékben jobb volt, mint 30 °C-on. A tenyészközegben termelt fahéjaldehid titerének HPLC-vel történő elemzése is azt mutatta, hogy a fahéjaldehid-termelés titerének 4,5-szerese volt 37 °C-on, mint 30 °C-on (2c. ábra). Feltételeztük, hogy a fahéjaldehid 37 °C-on történő magasabb termelési titerét az összes bioszintetikus enzim 37 °C-on történő fokozott expressziós szintje okozta, annak ellenére, hogy ezek az enzimek 30 °C-on is aktívak. A továbbiakban a fahéjaldehid előállítására szolgáló összes tenyésztést 37 °C-on végeztük.

Törzsmérnökség az l-fenilalanin intracelluláris pooljának növelésére

A fahéjaldehid bioszintéziséhez az l-fenilalaninra mint alapvető prekurzorra van szükség . Ezért a fahéjaldehid-termelés fokozása érdekében kívánatos az l-fenilalanin intracelluláris pooljának növelése. Ebből a célból racionálisan átterveztük az E. coli-t, hogy több l-fenilalanint termeljen. A rendelkezésre álló metabolikus és szabályozási információkat alapul véve az E. coli W3110-et a következőképpen alakítottuk ki: (i) a crr gén delécióját, amely a glükóz-specifikus foszfenolpiruvát-foszfotranszferáz rendszerhez (PTS) kapcsolódó EIIAGlc fehérjét kódolja a szubsztrátfelvételi sebesség mérséklése, a metabolit-túlcsordulás csökkentése és a prekurzorok dúsítása érdekében, (ii) a tyrR gén delécióját az aromás aminosav (AAA) szintézis génjeit tartalmazó TyrR regulon szoros szabályozásának enyhítése érdekében, (iii) a trpE (antranilát-szintáz komponens) és a tyrA gének deléciója a versengő útvonalak (l-triptofán és l-tirozin bioszintézise) szénáramlásának megakadályozása érdekében, és (iv) a pykA (piruvát-kináz A) gén deléciója a prekurzor dúsítása és a növekedés és az l-fenilalanin-termelés közötti fluxus kiegyensúlyozása érdekében (ábra. 3). A fenti séma alapján az E. coli W3110 öt egymást követő knockout mutánsát fejlesztettük ki (YHP01-YHP05) (1. táblázat).

Először egy glükóz-specifikus foszfenolpiruvát PTS-t inaktiváltunk a crr gén deléciójával az E. coli W3110 törzsben, így E. coli YHP01-et kaptunk. Bár ez megszakítja a glükóz internalizáció fő rendszerét, az YHP01 még mindig képes növekedni a glükózt egyedüli szénforrásként tartalmazó definiált táptalajon, mivel a mannóz-specifikus PTS és a galaktóz-permeáz továbbra is képes internalizálni a glükózt a citoplazmába . A PTS megkerülése a foszfenolpiruvát (PEP) megnövekedett poolját eredményezi, ami végső soron elősegíti az l-fenilalanin szintézisét . Ezután töröltük a tyrR gént az YHP01-ben, hogy YHP02 törzset kapjunk. A TyrR fehérje a TyrR regulon egyik szabályozója, amely nyolc, az AAA bioszintézisében részt vevő gént tartalmaz . A deléciója az AAA szintézishez kapcsolódó gének szoros szabályozásának enyhítésével az l-fenilalanin-poolt is növelheti. Ezután az YHP02 törzzsel kezdve szekvenciálisan deletáltuk a trpE és a tyrA géneket, így kaptuk az YHP03 és YHP04 törzseket. Az AAA-k bioszintézisének útvonalában egy végső elágazási pont következik be, ahol a kórismátot a PheA, TrpE vagy TyrA enzimek l-fenilalaninná, l-triptofánná vagy l-tirozinná alakíthatják. A trpE és a tyrA gének deléciója megakadályozhatja a szénveszteséget az l-triptofán és az l-tirozin bioszintézisének versengő útvonalaiba. Végül az YHP04-ben deletáltuk a pykA gént, hogy YHP05 törzset kapjunk. A pykA gén a piruvát-kináz A-t (PykA) kódolja, amely a második PEP-fogyasztó lépést jelenti. A pykA gén deléciójával több PEP használható fel a sikimát útvonalban, és következésképpen több l-fenilalanin termelhető. Az egyes törzsekben (YHP01-YHP05) a gének delécióját PCR és agaróz gélelektroforézissel igazoltuk (Additional file 3: S3 ábra).

Az összes módosított E. coli törzset, beleértve az YHP01-YHP05-öt és a szülői E. coli W3110-et, félig meghatározott táptalajt tartalmazó rázólombikban tenyésztettük, és összehasonlítottuk a sejtnövekedést és az l-fenilalanin termelést. A 48 órás tenyésztés után valamennyi módosított törzs valamivel jobban növekedett, mint a W3110 törzs; különösen az E. coli YHP05 törzs mutatta a legnagyobb sejtsűrűséget (4a. ábra). Egy korábbi tanulmány azt is megfigyelte, hogy a PTS és a Pyk izoenzimek inaktiválása növelte a biomassza képződéshez szükséges szénáramlást, mivel a csökkent glükózfelvétel és katabolizmus következtében csökkent mennyiségű köztes metabolitok konzerválódtak . HPLC-vel elemeztük az l-fenilalanin termelési titerét is a tenyésztési felülúszóban. A szülői W3110 törzsben az l-fenilalanin termelési titer 0,24 g/l volt, de az l-fenilalanin titer fokozatosan nőtt a módosított E. coli törzsekben (4a. ábra). Az E. coli YHP05, amelyben a crr, tyrR, trpE, tyrA és pykA géneket törölték, mutatta a legmagasabb l-fenilalanin termelési titert (0,52 g/L), amely 2,2-szerese volt a szülői E. coli W3110-nek. Ezért úgy döntöttünk, hogy az E. coli YHP05 törzset használjuk a további mérnöki munkához.

Plazmid alapú overexpressziós rendszer az l-fenilalanin intracelluláris pooljának növelésére

Az E. coli YHP05 törzsből kiindulva az l-fenilalanin termelését plazmid alapú gén overexpresszióval tovább javítottuk. Az l-fenilalanin szintézis útvonalában a shikimát és az l-fenilalanin által okozott visszacsatolt gátlást csökkentettük izoenzimek overexpressziójával vagy a shikimát útvonalban részt vevő enzimek mutációinak bevezetésével az alábbiak szerint: (i) az aroG-ben kódolt 3-deoxi-d-arabinoheptuloszonát-7-foszfát (DAHP) szintáz gén túlexpressziója mérnöki beavatkozással (AroG8/15), (ii) a shikimát-dehidrogenázt és shikimát-kinázt kódoló ydiB és aroK gének túlexpressziója a shikimát-útvonalba történő szénáramlás fokozása érdekében, (iii) a CHA mutáz/prefenát-dehidratázt kódoló pheA gén túlexpressziója a szubsztrátkötési affinitás javítása érdekében végzett mérnöki beavatkozással (PheAfbr, dm), és iv) a galP (galaktózpermeáz) és glk (glükokináz) gének túlexpressziója a glükózfelvétel megkönnyítése érdekében (Additional file 4: S4 ábra).

Először a visszacsatolási gátlás enyhítésére a pTac15kG plazmidot konstruáltuk, amely a módosított aroG8/15 gént tartalmazta. Az AroG a DAHP szintézisében részt vevő fő enzim, de az AroG-t teljesen gátolja az l-fenilalanin (már 0,1 mM) . Ismeretes, hogy két mutáció (D146N és A202T) bevezetése rezisztenciát eredményezett a visszacsatolásos gátlással szemben anélkül, hogy befolyásolta volna a magas specifikus aktivitását (AroG8/15) , ezért ezt a mutáns AroG8/15 enzimet túlterjesztettük. Ezután két plazmidot (pTac15kGB és pTac15kGBK) konstruáltunk az ydiB és az aroK géneknek az aroG8/15 génnel együtt történő túlterjesztésére. A shikimát útvonal metabolikus fluxusa fokozható, ha a shikimát-dehidrogenáz (YdiB) és a shikimát-kináz (AroK) géneket túlreprezentáljuk . Ezt követően pTac15kGBKA plazmidot is konstruáltunk a pheA gén túlterjesztésére, amely mutációkkal rendelkező korizmátmutázt/prefenát-dehidratázt kódol. Ebben a konstrukcióban csak a vad típusú PheA (PheAfbr) első 300 aminosavát amplifikáltuk, ami kizárja a szabályozó domént; ezért a PheAfbr-t gyengén befolyásolja a visszacsatolásos gátlás. Ezenkívül, mivel a PheAfbr-nek magasabb a Km-értéke, mint a vad típusú PheA-nak, ami a szubsztráthoz való csökkent kötődési affinitását tükrözi , két mutációt (E159A és E232A) vezettünk be a PheAfbr-be, hogy növeljük a szubsztrátkötő affinitását, így kaptuk a PheAfbr-t, dm . Végül pYHP plazmidot konstruáltunk a galP és glk gének további túlterjesztéséhez, amelyek a galaktózpermeázt, illetve a glükokinázt kódolják. Mindkét enzim elősegíti a glükózfelvételt .

Öt plazmid, köztük a pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA és pYHP (1. táblázat) előállítása után mindegyik plazmidot E. coli YHP05-be transzformáltuk. Félig meghatározott táptalajt tartalmazó rázólombikokban végzett 48 órás tenyésztés után elemeztük a sejtek növekedését és az l-fenilalanin termelési titerét. Minden sejt jól növekedett, és különösen a pYHP-t hordozó E. coli YHP05 sejtek a többinél valamivel nagyobb sejtsűrűségre nőttek (OD600 = 9,76) (4b. ábra). HPLC-vel elemeztük az l-fenilalanin termelési titerét is a tenyésztési felülúszóban. Az aroG8/15 gén (pTac15kG) overexpressziója az l-fenilalanin termelés jelentős növekedését eredményezte (2,25 g/l) a plazmidot nem tartalmazó YHP05-höz képest (0,52 g/l) (4b. ábra). Más gének későbbi overexpressziója az l-fenilalanin termelési titerének sorozatos növekedését eredményezte, és a pYHP-t hordozó E. coli YHP05 mutatta a legmagasabb l-fenilalanin termelési titerét (3,91 g/L) (4b. ábra). A pYHP plazmid hatására az l-fenilalanin termelés 16,4-szeresére, illetve 7,5-szeresére nőtt. A pYHP-t hordozó E. coli YHP05 tenyésztése során az l-fenilalanin hozam glükózon 0,270 g/g és 0,082 g/L/h volt (Additional file 5: S5 ábra). Így a pYHP-t hordozó, módosított E. coli YHP05-ben az l-fenilalanin pool jelentősen javult. Liu és munkatársai korábban arról számoltak be, hogy E. coli-ban az l-fenilalanin termelése elérte a 47 g/l-t . Ezt a rekordot azonban az etetett tételes tenyésztésben (15 L-es méretben) sikerült elérni, és az l-fenilalanin-transzporter (YddG) koexpresszióját alkalmazták az l-fenilalanin hatékony termelése érdekében a táptalajban. A mi munkánkban nem vezettük be az YddG-t, mert a végső célunk nem az l-fenilalanin, hanem a fahéjaldehid előállítása volt. Bár a munkánk során elért l-fenilalanin titer nem volt rekordmagas, úgy gondoltuk, hogy elég magas a fahéjaldehid előállításához. Ezért úgy döntöttünk, hogy ezt a módosított törzset használjuk a fahéjaldehid termelésére.

Fahéjaldehid termelés a módosított E. coli-ban

A pYHP-t hordozó módosított E. coli YHP05-t használva először a fahéjsav termelését vizsgáltuk. Ehhez a kísérlethez a pHB-CA plazmidot konstruáltuk, amely SmPAL gént tartalmaz IPTG-indukálható trc promóter alatt (1. táblázat). A pHB-CA-t és a pYHP-t egyaránt tartalmazó E. coli YHP05-öt lombikban 48 órán keresztül tenyésztettük, és elemeztük a fahéjsav termelési titerét. Kontrollként a pHB-CA-t hordozó (pYHP nélküli) E. coli YHP05 és E. coli W3110-et is vizsgáltuk. Az összes sejt növekedési mintázata hasonló volt (5a. ábra), a pHB-CA-t hordozó E. coli W3110 és YHP05 pedig 79, illetve 108 mg/l fahéjsavat termelt (5b. ábra). A pHB-CA-t és a pYHP-t egyaránt hordozó E. coli YHP05 jelentősen jobb termelési titerrel (287 mg/L) rendelkezett, amely 3,6-szer, illetve 2,7-szer magasabb volt, mint a pHB-CA-t hordozó E. coli W3110 és YHP05 esetében (5b. ábra). Legjobb tudomásunk szerint ez a termelési titer 1,5-szer magasabb volt az E. coli esetében jelentett legmagasabb szintnél (186 mg/L) is. Ez az eredmény egyértelműen azt jelzi, hogy az l-fenilalanin mennyiségének növelése a módosított E. coli törzsben pozitívan hozzájárul a fahéjsavtermelés növeléséhez.

Fő célként a pHB-CAD és pYHP transzformált E. coli YHP05 törzsben vizsgáltuk a fahéjaldehid termelést. Kontrollként vizsgáltuk továbbá a pHB-CAD-et hordozó (pYHP nélküli) E. coli YHP05 és E. coli W3110 törzseket is. A sejtek növekedése hasonló volt (6a. ábra), és a három fahéjaldehid bioszintetikus enzim jól kifejeződött minden vizsgált sejtben (Additional file 6: S6 ábra). A 48 órás lombiktenyésztést követően a tenyésztési felülúszókat összegyűjtöttük, és HPLC-vel meghatároztuk a fahéjaldehid termelési titereiket. Az E. coli W3110 (pHB-CAD) és az E. coli YHP05 (pHB-CAD) 2,18, illetve 6,3 mg/l fahéjaldehid-termelő titert mutatott (6b. ábra). Ezzel szemben az E. coli YHP05 (pHB-CAD és pYHP) lényegesen magasabb termelési titerrel rendelkezett (75 mg/L), amely 35-ször nagyobb volt, mint az E. coli W3110 (pHB-CAD) esetében.

A módosított E. coli által termelt fahéjaldehid nematicid aktivitása

A táptalajban termelt fahéjaldehid nematicid aktivitásának értékeléséhez a B. xylophilus fonálférgeket fahéjaldehiddel kezeltük a “Módszerek”-ben leírt eljárások szerint . A pYHP-t és pHB-CAD-ot hordozó E. coli YHP05 tenyésztési felülúszóját addig hígítottuk, amíg a fahéjaldehid végső koncentrációja 60 mg/l nem volt, és a fonálférgeket a hígított tenyésztési felülúszóval kezeltük. 1 és 4 óra elteltével a fonálférgek mindössze 26%-a, illetve 18%-a maradt életben (7. ábra). Pozitív kontrollként a fonálférgeket kereskedelmi forgalomban kapható és tisztított fahéjaldehiddel kezelték, azonos koncentrációban (60 mg/l). Négy óra elteltével majdnem minden fonálféreg (95 %) elpusztult. Ezek az eredmények azt jelezték, hogy a nematicid aktivitás hasonló volt a kereskedelmi forgalomban kapható fahéjaldehid és az ebben a vizsgálatban előállított fahéjaldehid között. Negatív kontrollként az E. coli W3110 tenyésztési felülúszót is vizsgáltuk, és a várakozásoknak megfelelően 4 óra elteltével szinte minden fonálféreg túlélte (>92 %).