Eredmények és vita
A DNS R.KpnI általi hasításának két módja Mg2+ jelenlétében.
A R.KpnI a legtöbb más REázzal ellentétben (11, 12) erősen promiszkuzív REáz az Mg2+ katalizált reakciókban. Az 1. A ábrán az R.KpnI jellegzetes hasítási mintázata látható Mg2+ koncentráció tartományban. A fémion alacsonyabb koncentrációinál (50-500 μM) csak a kognitív szekvencia hasítása volt megfigyelhető (2-5. sáv). Mg2+ >500 μM koncentrációknál azonban promiszkuláris hasítás volt megfigyelhető (6-9. sávok). Az R.KpnI általi hasítás Mg2+ koncentrációtól függő specifikus és promiszkva módját az oligonukleotidok hasításának elemzésével igazoltuk. A kanonikus szekvenciát tartalmazó oligonukleotid szubsztrátot az R.KpnI még 20 μM Mg2+ mellett is hatékonyan hasította. Ezzel szemben a nem kanonikus szekvenciákat csak >500 μM Mg2+ esetén hasította hatékonyan. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy az R.KpnI két különböző fémaktiválási profilt mutat – egyet a kanonikus és egyet a nem kanonikus DNS-szubsztrátokra. Az enzim a kanonikus szubsztrát esetében hiperbolikus fémaktiválási profilt, a nem kanonikus szubsztrát esetében pedig szigmoidális mintázatot követ (1. ábra B). Ezeket az adatokat Hill-diagram elemzésnek vetettük alá (S2. ábra; és lásd SI Text ), és a fémion-kötésre vonatkozó Hill-együtthatót az 1. táblázat mutatja be. A Hill plot elemzés feltárta a további fémion kötődését az enzimhez és annak szerepét a nem kanonikus szekvenciák hasításában. Úgy tűnt tehát, hogy az enzim aktív centrumához közeli vagy attól távoli további fémion toborzása szükséges ahhoz, hogy az enzim promiszkuláris hasítást indukáljon. Ha ez a helyzet, akkor a második helyen lévő fémion koordinációjában részt vevő maradékok mutációjának meg kell szüntetnie a promiszkuitás aktivitását, ami egy erősen szekvencia-specifikus enzimet eredményez. Ezt a hipotézist teszteltük.