DISCUSSION
Citrobacter freundii jelentős oka az opportunista fertőzéseknek; a C. diversus a bemutatott esetek mintegy 40%-át, míg a C. freundiire mintegy 29%-át képviseli (11). A Citrobacterspp. újszülöttkori meningitiszt okoz, és szokatlanul hajlamos agytályogot okozni (8, 14). Az agyhártyagyulladást és agytályogot okozó Citrobacter spp. patogenezise nem jól jellemezhető; azonban más agyhártyagyulladást okozó baktériumokhoz hasonlóan a vér-agy gáton való áthatolásnak kell történnie. A jelen vizsgálatot a Citrobacter és a vér-agy gát közötti lehetséges kölcsönhatások jobb megértése érdekében végeztük. A C. freundii-t választottuk modellbaktériumnak e vizsgálatokhoz, mivel a baktérium genetikája jobban meghatározott, és genomikus könyvtár áll rendelkezésre aCitrobacter HBMEC-ben történő inváziójának és szaporodásának molekuláris alapjaival kapcsolatos esetleges vizsgálatokhoz. A C. diversus cerebrospinalis folyadék izolátumával végzett kísérletek hasonló eredményeket hoztak (az adatok nem láthatóak), ami arra utal, hogy a HBMEC invázió gyakorisága és mechanizmusa e két faj esetében hasonló lehet.
A vér-agy gát egy komplex szerkezet, amely a choroid plexus epitheliumból és az agyi kapilláris endotheliumból áll. A szoros kötések jelenléte és az endotélsejtek alacsony pinocitotikus aktivitása a vér-agy gáton áthaladó makroelemek korlátozását eredményezi. Jelenleg nem ismert, hogy a vér-agy gáton belül hol hatol be a C. freundii, de a kísérletes hematogén Citrobacter-meningitis kísérleti hematogén patkánymodelljében a plexus chorioidea ritkán érintettnek bizonyult (16). Ezenkívül a vér-agy gát legnagyobb felületét az endoteliális mikrovaszkuláris sejtek borítják, és más meningitist okozó baktériumokról kimutatták, hogy in vitro behatolnak a mikrovaszkuláris endotélsejtekbe (13, 20, 25). Ezért vizsgálatunkhoz a HBMEC-et választottuk. Szövetkultúrás inváziós próbák és TEM-vizsgálatok bizonyították, hogy a C. freundii behatol a HBMEC-be. A különböző eukarióta sejtgátlók jelenlétében végzett inváziós vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy a C. freundii HBMEC-be történő inváziója mikrofilamentum-, mikrotubulus, de novo fehérjeszintézis és endoszóma savasodás függő folyamat. Kiterjesztett inváziós vizsgálatok megállapították, hogy a C. freundii hosszabb ideig képes in vitro intracellulárisan túlélni és szaporodni. A TEM-elemzések kimutatták, hogy az egyes és több C. freundii sejtek intracelluláris elhelyezkedése egymembrános vakuólaszerű struktúrákban található. Transzwell-kísérletek kimutatták, hogy a C. freundii képes áthatolni a HBMEC polarizált monorétegén, míg a nem invazív E. coli nem. Továbbá előzetes adataink azt mutatják, hogy a C. freundii áthatol a vér-agy gáton a kísérletes hematogén agyhártyagyulladás újszülöttkori patkány modelljében (21). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a C. freundii inváziót végez a vakuolumokba, valószínűleg replikálódik, transzcitál a HBMEC-en keresztül, a bazolaterális oldalra kerül, és így áthatol a vér-agy gáton.
A C. freundii eukarióta sejtek inváziójáról már beszámoltak (22, 35). Ez azonban az első jelentés a HBMEC C. freundii általi inváziójáról. Érdekes módon a C. freundii invázió eukarióta követelményei éppoly változatosak, mint azok a sejttípusok, amelyekbe a C. freundii bizonyítottan behatol. Például az MDC klatrin bevonatú gödörgátlóról kimutatták, hogy gátolja a C. freundii invázióját minden más vizsgált sejttípusban (pl. humán érrendszeri, bél- és hólyaghámsejtekben), kivéve – mint ebben a vizsgálatban is – a HBMEC-ben. Ezenkívül más, eddig jellemzett meningitist okozó baktériumok olyan úton (utakon) jutnak be a HBMEC-be, amely(ek) a mikrotubulusoktól függ(nek) és MDC-érzékeny(ek) (20, 24, 27). Az MDC és az ouabain klatrin-bevonatú gödrök gátlóiról kimutatták, hogy nem gátolják az összes receptort; így lehetséges, hogy a C. freundii HBMEC-be való behatolásához szükséges receptort nem befolyásolja az MDC vagy az ouabain gátló. Bár az eddig összegyűjtött bizonyítékok arra utalnak, hogy a C. freundii HBMEC-be való belépése nem az MDC- vagy oabain-érzékeny receptor-mediált úton keresztül történik, úgy tűnik, hogy az endoszóma savasodása és a de novo fehérjeszintézis egyaránt szükséges. A rendelkezésre álló adatok két lehetséges forgatókönyvre utalnak. Az endoszóma savasodására környezeti kiváltó tényezőként lehet szükség az intracelluláris bakteriális túléléshez. Hasonló követelményeket jellemeztek a Salmonella epithelialis inváziójához (26). Alternatív megoldásként az endoszóma savasodása és fehérjeszintézise szükséges lehet a ligandum-receptor komplex szétválasztásához, a receptor szintéziséhez és/vagy a receptor HBMEC felszínre történő prezentálásához a C. freundii invázióhoz. Ez utóbbi forgatókönyv más invazív kórokozókra emlékeztet, ahol az életképes organizmus érintkezése szükséges az invázióhoz szükséges eukarióta sejtadhéziós molekulák modulációjához (pl. Streptococcus pneumoniae és a trombocita aktiváló faktor receptor) (2). Laboratóriumunkban jelenleg is folynak kísérletek e javasolt forgatókönyvek megkülönböztetésére.
A mikrotubulus-gátlók (depolimerizáló és stabilizáló szerek egyaránt) jelenlétében végzett inváziós vizsgálatok jelentősen csökkentették a HBMEC C. freundii felvételére való képességét. Az anti-α-tubulin antitestekkel végzett konfokális mikroszkópiás kísérletek kimutatták, hogy a mikrotubulusok aggregálódnak, miután a HBMEC kapcsolatba került a C. freundii-vel. A mikrotubulus aggregáció időfüggő folyamat volt; 5 perc alatt nem volt megfigyelhető aggregáció, 15 perc alatt kevés, és egyértelmű aggregáció volt megfigyelhető a C. freundii és a HBMEC 30 perces inkubációja után. Ezt a mikrotubulusaggregációt gátolta, ha a sejteket mikrotubulusgátlókkal vagy mikrofilamentum-gátló szerekkel kezelték. Érdekes, hogy a mikrotubulus aggregáció festési mintázata nem kolokalizálódott a baktérium kötődésével, és a HBMEC azon területei, amelyek nem mutattak C. freundii kötődést, szintén kifejezett mikrotubulus csomósodást mutattak. Ez arra utal, hogy a baktérium HBMEC-vel való érintkezése globálisan stimulálhatja a mikrotubulus aggregációt. Hogy a mikrotubulus aggregáció egy szekretált bakteriális faktor vagy a HBMEC-hez kötődő baktériumokra adott parakrin válasz eredménye-e, még nem tudjuk. Továbbá, a mikrotubulusok aggregációja a C. freundii kötődésére adott válaszként összefüggésben lehet a posztulált receptor prezentációval a de novo fehérjeszintézisen és az endoszóma savasodásán keresztül. Korábban kimutatták, hogy számos receptor transzportja a sejtfelszínre és a sejtfelszínről a mikrotubulusoktól függ (10). Ezért a mikrotubulus-inhibitorok gátló hatásának egyik magyarázata a C. freundii HBMEC-be való belépésére az, hogy a szerek csökkenthetik a C. freundiiinvasziót közvetítő HBMEC-receptorok számát. Kísérletek folynak e lehetőségek megkülönböztetésére.
A mikrotubulusokról korábban kimutatták, hogy számos kórokozó (pl. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropatogén és enterohemorrhagiás E. coli és Campylobacter jejuni) inváziójához szükségesek (4, 9, 22, 23, 29). Az általános vélekedés az volt, hogy bár ezek a kórokozók mikrotubulusfüggő utakon keresztül juthatnak be, általában nem szaporodnak intracellulárisan (6). Az ebben a vizsgálatban a kiterjesztett inváziós próbákból és a TEM-elemzésből nyert adatok azt sugallják, hogy aC. freundii kivételt képezhet ez alól az általánosítás alól. Ellentétben egy másik intravacuolárisan szaporodó baktérium, a Legionella pneumophila esetében leírtakkal(12), itt nem jelentek meg mitokondriumok vagy riboszómák a baktériumok közvetlen közelében. Ez arra utal, hogy a C. freundii nem használja ezeket a szervezredeket közvetlen energiaszerzésre, vagy hogy a specifikus gazdasejt-fehérjék toborzása nem szükséges az intracelluláris túléléshez és szaporodáshoz (mint a L. pneumophila esetében). A központi idegrendszeri fertőzések szempontjából különösen fontos, hogy más meningitist okozó baktériumok, mint az E. coli K1, a GBS és a S. pneumoniae hasonló módon inváziót (1, 13, 25) vagy inváziót és transzcitózist (20, 27) mutattak ki a BMEC-ben; azonban ezek az organizmusok nem szaporodtak a HBMEC-ben. Amint fentebb leírtuk, a Citrobacter meningitis dokumentáltan nagy gyakorisággal fordul elő agyi tályogok kialakulásában. Azt, hogy a HBMEC vakuolumaiban történő replikáció egyedülálló-e a Citrobacter esetében, és hogy van-e összefüggés a tályogképződéssel, még meg kell határozni.
A citokalazin D gátolja a C. freundii HBMEC-be való behatolását; immunfestéssel azonban nem találtuk a mikrofilamentumok kimutatható átrendeződését, amikor a C. freundii kölcsönhatásba lépett a HBMEC-vel (adat nem látható). Ezenkívül a HBMEC citokálin D előkezelése gátolta a baktériumtól függő mikrotubulus aggregációt, amint azt konfokális mikroszkópiával vizualizáltuk. Ezeknek az eredményeknek több magyarázata is lehet. A citokalsin D hatása a baktériumfüggő mikrotubulus aggregációra a mikrofilamentumok gátlójának a mikrotubulushálózatra gyakorolt közvetett hatása lehet. Megfigyelték például, hogy a mikrotubulusok az F-aktin horgonyzó struktúrájaként működnek (28). Ezért a mikrofilamentum-hálózat megzavarása hatással lehet a mikrotubulus-hálózatra, és így közvetve befolyásolhatja a HBMEC mikrotubulusfüggő C. freundii invázióját. Alternatív megoldásként egy aktin-függő inváziós lépés megelőzheti a mikrotubulusfüggő lépést a C. freundii HBMEC inváziójában. Ez a kezdeti lépés mikrofilamentum-átrendeződést eredményezhet, amikor a baktériumok kezdetben érintkeznek a HBMEC-vel; ezek az események azonban átmenetiek lehetnek, és az immunfluoreszcens mikroszkópiát alkalmazó kísérleti elrendezés nem biztos, hogy megfelelően kimutatja előfordulásukat. Hasonló a helyzet a Yersiniainvasin-mediált invázió esetében is (36). Ezért, ha az invázió kezdeti szakaszait a citokalapin D megakadályozza, az invázió későbbi, mikrotubulusfüggő szakaszai nem indulnak el. Korábban kimutatták, hogy az aktin szerepet játszik az aktinkötő fehérje faktorok transzlokációjában a plazmamembránba, valamint a citoszolikus jelátvitelben (19). Ezenkívül a citokalazin D gátolja a Salmonella behatolását az aktinkötő fehérjéknek a baktérium behatolási helyére történő transzlokációjának megszakításán keresztül (7). Lehetséges, hogy a HBMEC C. freundii inváziója esetén az aktin mikrofilamentumok szükségesek a citoszolikus jelátvitelhez és/vagy a bakteriális penetrációhoz a plazmamembránon, a mikrotubulusok pedig a membránhoz kötött baktériumok plazmamembránból a bazolaterális oldal felé (vagy éppen mélyebbre a sejtbe) történő szállításához. Így az invázió bármelyik szakaszában bekövetkező zavar “forgalmi dugót” eredményezne.”
Összefoglalva, az itt bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a C. freundii képes in vitro behatolni, szaporodni a HBMEC-ben, és transzcitálni azt. E fenotípusok genetikai alapjainak meghatározása jelentős betekintést nyújt a Citrobactermeningitis patofiziológiájába, és potenciálisan segíthet új terápiás és megelőző stratégiák kifejlesztésében. Továbbá a Citrobacter és más agyhártyagyulladást okozó baktériumok átfogó molekuláris összehasonlító elemzése fényt deríthet a Citrobacter egyedülálló tulajdonságára, az agyi tályogképződésre.