Back to Basics – Mi az immunoassay – Letölthető PDF verzió
Mi az immunoassay vagy ELISA?
Az immunoassay gyors és pontos tesztek, amelyek a helyszínen és a laboratóriumban használhatók specifikus molekulák kimutatására. Az immunoassayk az antitestek azon eredendő képességére támaszkodnak, hogy egy molekula specifikus szerkezetéhez kötődjenek. Az antitestek olyan fehérjék, amelyeket az állatok egy idegen molekula (antigén) szervezetbe való behatolására válaszul termelnek. Az antitestek megtalálhatók a vérben és a szövetnedvekben, és az antigénhez kötődnek, amikor csak találkoznak vele. Mivel az antitesteket egy antigén vagy analit specifikus háromdimenziós szerkezetére fejlesztették ki, rendkívül specifikusak, és csak ehhez a szerkezethez kötődnek. A vérből megtisztítva a monoklonális és poliklonális antitestek ideális vizsgálati reagensek a specifikus célmolekulák kimutatására és nyomon követésére, más anyagokból származó korlátozott interferenciával. Négy tipikus ELISA formátum a következő: antitest szendvics-immunpróbák, antigén-down immunpróbák, kompetitív gátlási próbák és gyorspróbák.
Az antitest szendvics-immunpróba
A tipikus antitest szendvics-immunpróbában a monoklonális antitestet egy műanyag mikrotiterlemezre adszorbeálják. Amikor a vizsgált mintát a lemezhez adjuk, a lemezen lévő antitest megköti a célantigént a mintából, és a lemezben tartja azt. Amikor a következő lépésben poliklonális antitestet adunk hozzá, az is kötődik a célantigénhez (amely már a lemezen lévő monoklonális antitesthez kötődött), így egy antigén “szendvicset” képez a két különböző antitest között.
– 1. lépés: Monoklonális antitesteket adszorbeálunk egy műanyag mikrotiterlemez üregébe bevonatpufferrel (minta hozzáadása nélkül).
– 2. lépés: Minta (például emberi vér, megfelelően hígítva) hozzáadása a mikrotiterlemez üregéhez. A célantigén kötődik a lemezen adszorbeált antitesthez, az antigént a mélyedésben tartva.
– 3. lépés: Egy enzimkonjugált poliklonális antitest kötődése a célantigénhez (amely a lemezen lévő monoklonális antitesthez kötődik), ezáltal egy antigén “szendvics” alakul ki a két különböző antitest között.
– 4. lépés: Az enzimkonjugált poliklonális antitestek kimutatására szolgáló kolorimetrikus szubsztrát hozzáadása egy színjelet hoz létre, amely arányos a lemezhez hozzáadott eredeti mintában jelen lévő célantigén mennyiségével.
Az antigén-csökkentő (immunitásteszt) immunoassay
Az antigén-csökkentő (immunitásteszt) immunoassayben az analit bevonatát a mintában található antitestek megkötésére használják. A minta (például emberi szérum) hozzáadásakor a lemezen lévő antigént a mintából származó antitestek (például IgE) kötik meg, amelyek aztán a mélyedésben maradnak. Ezután egy HRP-vel jelölt fajspecifikus antitestet (például anti-humán IgE-t) adunk hozzá, amely a lemezen lévő antigénhez kötött antitesthez kötődik. Minél nagyobb a jel, annál több antitest van a mintában. Az antigén-down (immunitásteszt) próbák gyorstesztként konfigurálhatók, és gyakran használják allergiás állapotok diagnosztizálására – rutinszerűen a beteg vérét különböző allergénekkel szemben vizsgálják, hogy kiderüljön, az illetőnek vannak-e antitestjei az adott allergénnel szemben.
Kompetitív gátlásos immunpróba
A monoklonális-poliklonális (Mo-Po) antitest szendvics formátum mellett számos immunpróba kompetitív gátlásos formátumban van felépítve. A kompetitív gátlásos vizsgálatokat gyakran használják kis analitok mérésére, mivel a kompetitív gátlásos vizsgálatok csak egy antitest kötődését igénylik, nem pedig kettőt, mint a standard ELISA formátumokban. Mivel nagy a valószínűsége annak, hogy sterikus akadályok lépnek fel, amikor két antitest egyszerre próbál kötődni egy kis molekulához, a szendvicsvizsgálati formátum nem feltétlenül kivitelezhető. Ezért a kompetitív gátlási vizsgálat lenne előnyösebb.
A szekvenciális kompetitív gátlási vizsgálatban a mintát és a konjugált analitot a szendvicsvizsgálathoz hasonlóan lépésekben adják hozzá, míg a klasszikus kompetitív gátlási vizsgálatban ezeket a reagenseket egyszerre inkubálják. A szekvenciális kompetitív gátlási próba formátumában egy monoklonális antitestet egy 96 lyukú mikrotiterlemezre kell felvinni. A minta hozzáadásakor a MoAb a mintából szabad analitot köt ki. A következő lépésben ismert mennyiségű, biotinnal vagy HRP-vel jelölt analitot adunk hozzá. A jelölt analit ezután szintén megpróbál kötődni a lemezre adszorbeált MoAb-hoz, azonban a jelölt analitot gátolja a MoAb-hoz való kötődésben a mintából korábban megkötött analit jelenléte. Ez azt jelenti, hogy a jelölt analit nem kötődik a lemezen lévő monoklonális anyaghoz, ha a monoklonális anyag már megköti a mintából származó, nem jelölt analitot. A mintában lévő nem jelölt analit mennyisége fordítottan arányos a jelölt analit által generált jellel. Minél kisebb a jel, annál több nem jelölt analit van a mintában. A standardgörbét egy nem jelölt analit standard sorozatos hígításával lehet elkészíteni. Az ezt követő mintaértékek ezután leolvashatók a standard görbéről, ahogyan a szendvics ELISA-formátumoknál is történik. A klasszikus kompetitív gátlásos vizsgálati formátumban egyszerre kell címkézett (konjugált analit) és nem címkézett analitot (a mintából) hozzáadni. Mind a jelölt, mind a nem jelölt analit egyidejűleg versenyez a lemezen lévő monoklonális befogadó antitest kötőhelyéért. A szekvenciális kompetitív gátlási formátumhoz hasonlóan a színes jel fordítottan arányos a mintában lévő nem jelölt célanalit koncentrációjával. A jelölt analit kimutatása peroxidáz-szubsztrát, például TMB használatával történhet, amely mikrotiterlemez-olvasóval leolvasható.
Gyors immunpróba
A mikrotiterlemezek mellett az immunpróba gyors tesztként is konfigurálható, például otthoni terhességi tesztként. A mikrotiterlemezes vizsgálatokhoz hasonlóan a gyorstesztek is antitesteket használnak az antigénekkel való reakcióhoz, és kialakíthatók MoAb-PoAb szendvicsformátumok, kompetitív gátlási formátumok és antigén-lefelé irányuló formátumok. A gyorsteszteknél az antitest és az antigén reagenseket porózus membránokhoz kötik, amelyek reagálnak a pozitív mintákkal, miközben a felesleges folyadékot a membrán egy nem reagáló részébe vezetik. A gyors immunpróbák általában 2 konfigurációban készülnek: laterális áramlásos teszt, ahol a mintát egyszerűen egy lyukba helyezik, és az eredményt azonnal leolvassák; és átfolyásos rendszer, amelynél a mintát egy lyukba kell helyezni, a lyukat ki kell mosni, majd végül egy analitikus-kolloidális arany konjugátumot kell hozzáadni, és az eredményt néhány perc múlva leolvassák. Csíkonként vagy kazettánként egy mintát vizsgálnak. Mivel a gyorstesztek gyorsabbak, mint a mikrotiterlemezes vizsgálatok, kevés mintafeldolgozást igényelnek, gyakran olcsóbbak, és műszer használata nélkül igen/nem válaszokat adnak, gyakran használják őket a terepen a teljes mintákat vizsgáló, nem laboratóriumban dolgozó személyek. A gyors immunpróbák azonban nem olyan érzékenyek, és nem is használhatók az analit pontos mennyiségi meghatározására (a cukorbetegek vércukorszintjének önellenőrzése kvantitatív gyorstesztnek minősül, azonban az immunpróba-technológiát nem használják ezeknél a teszteknél). Minden immunpróba-gyorsteszt átalakítható mikrotiterlemezes tesztté, de nem minden mikrotiterlemezes teszt alakítható át gyorstesztté.
