Retour aux sources – Qu’est-ce qu’un dosage immunologique – Version PDF téléchargeable
Qu’est-ce qu’un dosage immunologique ou ELISA ?
Les dosages immunologiques sont des tests rapides et précis qui peuvent être utilisés sur site et en laboratoire pour détecter des molécules spécifiques. Les immunoessais reposent sur la capacité inhérente d’un anticorps à se lier à la structure spécifique d’une molécule. Les anticorps sont des protéines générées par les animaux en réponse à l’invasion d’une molécule étrangère (antigène) dans l’organisme. Les anticorps sont présents dans le sang et les fluides tissulaires et se lient à l’antigène chaque fois qu’il est rencontré. Comme les anticorps sont développés en fonction de la structure tridimensionnelle spécifique d’un antigène, ou analyte, ils sont très spécifiques et ne se lient qu’à cette structure. Une fois purifiés du sang, les anticorps monoclonaux et polyclonaux sont des réactifs de test idéaux pour détecter et surveiller des molécules cibles spécifiques avec des interférences limitées d’autres substances. Quatre formats ELISA typiques sont : les immunodosages en sandwich d’anticorps, les immunodosages par abaissement d’antigène, les tests d’inhibition compétitive et les tests rapides.
Immunodosage en sandwich d’anticorps
Dans un immunodosage en sandwich d’anticorps typique, un anticorps monoclonal est adsorbé sur une plaque de microtitration en plastique. Lorsque l’échantillon à tester est ajouté à la plaque, l’anticorps de la plaque se lie à l’antigène cible de l’échantillon et le retient dans la plaque. Lorsqu’un anticorps polyclonal est ajouté à l’étape suivante, il se lie également à l’antigène cible (déjà lié à l’anticorps monoclonal sur la plaque), formant ainsi un « sandwich » d’antigène entre les deux différents anticorps.
– Étape 1 : les anticorps monoclonaux sont adsorbés sur le puits d’une plaque de microtitration en plastique avec un tampon d’enrobage (sans ajout d’échantillon).
– Étape 2 : ajout d’un échantillon (tel que du sang humain, dilué de manière appropriée) dans le puits de la plaque de microtitration. L’antigène cible se lie à l’anticorps adsorbé sur la plaque, retenant l’antigène dans le puits.
– Étape 3 : Liaison d’un anticorps polyclonal conjugué à une enzyme à l’antigène cible (lié à l’anticorps monoclonal sur la plaque), formant ainsi un » sandwich » d’antigène entre les deux différents anticorps.
– Étape 4 : L’ajout d’un substrat colorimétrique pour la détection des anticorps polyclonaux conjugués à une enzyme générera un signal de couleur proportionnel à la quantité d’antigène cible présent dans l’échantillon original ajouté à la plaque.
Immunoessai de descente d’antigène (test d’immunité)
Dans un immunoessai de descente d’antigène (test d’immunité), l’analyte est enduit utilisé pour lier les anticorps présents dans un échantillon. Lorsque l’échantillon est ajouté (tel que le sérum humain), l’antigène sur la plaque est lié par les anticorps (IgE par exemple) de l’échantillon, qui sont ensuite retenus dans le puits. On ajoute ensuite un anticorps spécifique de l’espèce (anti-IgE humaine par exemple) marqué à la HRP, qui se lie à l’anticorps lié à l’antigène sur la plaque. Plus le signal est élevé, plus l’échantillon contient d’anticorps. Les tests de descente d’antigène (test d’immunité) peuvent être configurés comme des tests rapides et sont souvent utilisés pour diagnostiquer les conditions d’allergie – de manière routinière, le sang d’un patient est testé contre différents allergènes pour voir si la personne a des anticorps contre cet allergène.
Test immunologique d’inhibition compétitive
En plus du format sandwich d’anticorps monoclonal-polyclonal (Mo-Po), de nombreux tests immunologiques sont structurés dans un format d’inhibition compétitive. Les tests d’inhibition compétitive sont souvent utilisés pour mesurer de petits analytes car les tests d’inhibition compétitive ne nécessitent que la liaison d’un seul anticorps au lieu de deux, comme dans les formats ELISA standard. En raison de la forte probabilité d’un encombrement stérique lorsque deux anticorps tentent de se lier à une petite molécule en même temps, un format d’essai sandwich peut ne pas être réalisable. Par conséquent, un essai d’inhibition compétitive serait préférable.
Dans un essai d’inhibition compétitive séquentielle, l’échantillon et l’analyte conjugué sont ajoutés par étapes comme dans un essai sandwich, alors que dans un essai d’inhibition compétitive classique, ces réactifs sont incubés ensemble en même temps. Dans un format de test d’inhibition compétitive séquentielle, un anticorps monoclonal est déposé sur une plaque de microtitration à 96 puits. Lorsque l’échantillon est ajouté, l’anticorps monoclonal capture l’analyte libre de l’échantillon. Dans l’étape suivante, une quantité connue d’analyte marqué à la biotine ou au HRP est ajoutée. L’analyte marqué va alors également tenter de se lier au MoAb adsorbé sur la plaque, cependant, l’analyte marqué est empêché de se lier au MoAb par la présence de l’analyte précédemment lié à l’échantillon. Cela signifie que l’analyte marqué ne sera pas lié par le monoclonal sur la plaque si le monoclonal a déjà lié l’analyte non marqué de l’échantillon. La quantité d’analyte non marqué dans l’échantillon est inversement proportionnelle au signal généré par l’analyte marqué. Plus le signal est faible, plus il y a d’analyte non marqué dans l’échantillon. Une courbe standard peut être construite en utilisant des dilutions en série d’un analyte standard non marqué. Les valeurs des échantillons suivants peuvent ensuite être lues à partir de la courbe standard, comme c’est le cas dans les formats ELISA en sandwich. Le format classique du test d’inhibition compétitive nécessite l’ajout simultané d’un analyte marqué (analyte conjugué) et d’un analyte non marqué (provenant de l’échantillon). L’analyte marqué et l’analyte non marqué entrent alors simultanément en compétition pour le site de liaison de l’anticorps de capture monoclonal sur la plaque. Comme dans le format d’inhibition compétitive séquentielle, le signal coloré est inversement proportionnel à la concentration de l’analyte cible non marqué dans l’échantillon. La détection de l’analyte marqué peut être faite en utilisant un substrat de peroxydase tel que le TMB, qui peut être lu sur un lecteur de plaque de microtitration.
Immunoessai rapide
En plus des plaques de microtitration, les immunoessais sont également configurés comme des tests rapides, tels qu’un test de grossesse à domicile. Comme les tests sur plaques de microtitration, les tests rapides utilisent des anticorps pour réagir avec des antigènes et peuvent être développés en tant que formats sandwich MoAb-PoAb, formats d’inhibition compétitive et formats d’abaissement de l’antigène. Dans un test rapide, les réactifs de l’anticorps et de l’antigène sont liés à des membranes poreuses, qui réagissent avec les échantillons positifs tout en canalisant les fluides en excès vers une partie non réactive de la membrane. Les immunodosages rapides se présentent généralement sous deux configurations : un test à flux latéral, où l’échantillon est simplement placé dans un puits et les résultats sont lus immédiatement ; et un système à flux continu, qui nécessite de placer l’échantillon dans un puits, de laver le puits, puis d’ajouter finalement un conjugué d’or analytecolloïdal et le résultat est lu après quelques minutes. Un échantillon est testé par bande ou par cassette. Étant donné que les tests rapides sont plus rapides que les tests sur plaques de microtitration, qu’ils nécessitent peu de traitement des échantillons, qu’ils sont souvent moins chers et qu’ils génèrent des réponses oui/non sans utiliser d’instrument, ils sont souvent utilisés sur le terrain par des personnes ne travaillant pas en laboratoire pour tester des échantillons entiers. Cependant, les immunodosages rapides ne sont pas aussi sensibles et ne peuvent pas être utilisés pour quantifier précisément un analyte (l’autosurveillance de la glycémie par les diabétiques est considérée comme un test rapide quantitatif, mais la technologie des immunodosages n’est pas utilisée pour ces tests). Tous les tests immunologiques rapides peuvent être convertis en un test sur plaque de microtitration, mais tous les tests sur plaque de microtitration ne peuvent pas être convertis en un test rapide.
