Ingénierie métabolique d’Escherichia coli pour la production de cinnamaldéhyde

Sélection d’enzymes pour la biosynthèse du cinnamaldéhyde

Le cinnamaldéhyde peut être synthétisé à partir de l-phénylalanine et sa biosynthèse nécessite trois réactions enzymatiques : (i) désamination de la l-phénylalanine en acide cinnamique par la phénylalanine-ammoniac lyase (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) ligature acide-thiol de l’acide cinnamique en cinnamoyl-CoA par la 4-coumarate:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), et (iii) la réduction du cinnamoyl-CoA en cinnamaldéhyde par la cinnamoyl-CoA réductase (CCR, EC 1.2.1.44) (Fig. 1a). La PAL est une enzyme ubiquitaire que l’on trouve dans de nombreuses plantes, champignons et certaines bactéries, et elle possède diverses activités et spécificités selon l’origine de l’enzyme. Nous avons examiné deux enzymes PAL, l’une provenant de la plante Arabidopsis thaliana (AtPAL) et l’autre de la bactérie Streptomyces maritimus (SmPAL), pour leur aptitude à produire de l’acide cinnamique dans E. coli. Dans le cas de l’AtPAL, il existe quatre isomères, de l’AtPAL1 à l’AtPAL4, et il a été signalé précédemment que la plupart d’entre eux (AtPAL1, 2 et 4) ont des activités supérieures à celles de l’AtPAL3 pour la l-phénylalanine en tant que substrat, nous avons donc choisi l’AtPAL1 comme représentant de la source végétale. Leurs constantes cinétiques (Km) ont été rapportées comme étant de 68 et 23 μM, respectivement. Chaque enzyme PAL étiquetée His a été produite dans E. coli BL21(DE3) et purifiée selon les procédures décrites dans  » Methods « . Les deux enzymes, AtPAL1 (78 kDa) et SmPAL (56 kDa), ont été purifiées avec succès (fichier supplémentaire 1 : figure S1). Bien que le niveau d’expression d’AtPAL1 ne soit pas si élevé que la bande ne puisse être vue dans les voies 1 et 2 de la SDS-PAGE, la bande d’AtPAL1 a pu être clairement vue après la chromatographie sur colonne d’affinité dans la voie 3 dans laquelle l’éluat concentré a été chargé. La molarité équivalente de chaque enzyme PAL purifiée a été incubée avec la même quantité de l-phénylalanine (comme substrat), et le titre de production de l’acide cinnamique a été quantifié par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (fichier supplémentaire 2 : figure S2). Comme le montre la figure 1b, SmPAL a présenté une activité significativement plus élevée (21 fois à la réaction de 30 °C et 27 fois à la réaction de 37 °C) que celles de AtPAL1.

Nous avons également examiné deux enzymes 4CL différentes, l’une provenant de Streptomyces coelicolor (ScCCL) et l’autre de A. thaliana (At4CL), pour leur aptitude à convertir l’acide cinnamique en cinnamaldéhyde dans E. coli. Dans le cas de At4CL, il est connu qu’il y a 14 isoformes putatifs (At4CL1-At4CL14) . Parmi les 14 isoformes, At4CL1-3 ont des activités similaires au cinnamate alors que les autres isoformes ne le font pas. Par conséquent, nous avons choisi l’At4CL1 comme représentant. Nous avons également utilisé l’enzyme CCR de A. thaliana (AtCCR1) pour la conversion du cinnamoyl-CoA en cinnamaldéhyde. Chaque enzyme 4CL (At4CL1 et ScCCL) a été testée en combinaison avec l’enzyme CCR de A. thaliana (AtCCR). Toutes les enzymes ont été purifiées avec succès avec une grande pureté (Fichier additionnel 1 : Figure S1). Pour comparer les activités enzymatiques de At4CL1 et ScCCL, deux réactions, (i) At4CL1 avec AtCCR et (ii) ScCCL avec AtCCR, ont été préparées et mélangées avec de l’acide cinnamique comme substrat. Après incubation à 30 et 37 °C, le titre de cinnamaldéhyde a été analysé par HPLC. Comme le montre la figure 1c, la combinaison de ScCCL et d’AtCCR a donné lieu à un titre de production de cinnamaldéhyde plus élevé (4,4 fois à la réaction de 30 °C et 10,4 fois à la réaction de 37 °C) que la combinaison d’At4CL1 et d’AtCCR. Sur la base de ces résultats, nous avons construit le système de biosynthèse du cinnamaldéhyde dans E. coli comme décrit ci-dessous en utilisant les enzymes suivantes : SmPAL, ScCCL, et AtCCR.

Construction de la voie de biosynthèse du cinnamaldéhyde dans E. coli

Pour produire le cinnamaldéhyde dans E. coli, les gènes SmPAL, ScCCL, et AtCCR ont été clonés dans pTrc99A dans l’ordre suivant : SmPAL, ScCCL et AtCCR (ce qui donne pHB-CAD) (Fig. 2a). E. coli W3110 hébergeant pHB-CAD a été cultivé à deux températures différentes (30 et 37 °C) afin de trouver la température optimale pour la production de cinnamaldéhyde. L’expression des enzymes a été analysée par SDS-PAGE, suivie d’une analyse par western blot comme décrit dans « Méthodes ». Aux deux températures, toutes les enzymes étaient bien exprimées et hautement solubles (Fig. 2b). Bien que chaque enzyme ait été exprimée à un niveau différent, l’expression de chaque enzyme était marginalement meilleure à 37 °C qu’à 30 °C. De plus, l’analyse du titre de cinnamaldéhyde produit dans le milieu de culture par HPLC a révélé que le titre de production de cinnamaldéhyde était 4,5 fois plus élevé à 37 °C qu’à 30 °C (Fig. 2c). Nous avons supposé que le titre de production plus élevé de cinnamaldéhyde à 37 °C était dû à l’augmentation du niveau d’expression de toutes les enzymes biosynthétiques à 37 °C, même si ces enzymes sont actives à 30 °C. Par la suite, toutes les cultures pour la production de cinnamaldéhyde ont été réalisées à 37 °C.

Ingénierie des souches pour augmenter le pool intracellulaire de l-phénylalanine

Pour la biosynthèse du cinnamaldéhyde, la l-phénylalanine est requise comme précurseur essentiel . Par conséquent, pour améliorer la production de cinnamaldéhyde, il est souhaitable d’augmenter le pool intracellulaire de l-phénylalanine. À cette fin, nous avons redessiné rationnellement E. coli pour produire davantage de l-phénylalanine. En utilisant les informations métaboliques et réglementaires disponibles comme guide, nous avons modifié E. coli W3110 comme suit : (i) délétion du gène crr qui encode la protéine EIIAGlc liée au système phosphoénolpyruvate phosphotransférase (PTS) spécifique du glucose pour modérer le taux d’absorption du substrat, diminuer le débordement du métabolite et enrichir les précurseurs, (ii) délétion du gène tyrR pour alléger la régulation étroite du régulon TyrR qui contient les gènes de synthèse des acides aminés aromatiques (AAA), (iii) la délétion des gènes trpE (composant de l’anthranilate synthase) et tyrA pour empêcher la perte du flux de carbone dans les voies concurrentes (biosynthèse de l-tryptophane et de l-tyrosine), et (iv) la délétion du gène pykA (pyruvate kinase A) pour enrichir le précurseur et équilibrer le flux entre la croissance et la production de l-phénylalanine (Fig. 3). Sur la base du schéma ci-dessus, cinq mutants knockout séquentiels de E. coli W3110 ont été développés (YHP01-YHP05) (Tableau 1).

Premièrement, un phosphoenolpyruvate PTS spécifique au glucose a été inactivé par délétion du gène crr dans la souche E. coli W3110, ce qui a donné E. coli YHP01. Bien que cela perturbe le principal système d’internalisation du glucose, YHP01 peut toujours se développer dans des milieux définis contenant du glucose comme seule source de carbone, car le PTS spécifique du mannose et la perméase du galactose peuvent continuer à internaliser le glucose dans le cytoplasme. Le contournement du PTS entraîne une augmentation du pool de phosphoénolpyruvate (PEP), qui facilite finalement la synthèse de la l-phénylalanine. Ensuite, nous avons supprimé le gène tyrR dans la souche YHP01 pour obtenir la souche YHP02. La protéine TyrR est un régulateur du régulon TyrR, qui contient huit gènes impliqués dans la biosynthèse de l’AAA . Sa délétion peut également augmenter le pool de l-phénylalanine en atténuant la régulation étroite des gènes liés à la synthèse de l’AAA. Nous avons ensuite supprimé séquentiellement les gènes trpE et tyrA en commençant par la souche YHP02, ce qui a donné les souches YHP03 et YHP04, respectivement. Dans la voie de biosynthèse des AAA, un point de branchement final se produit où le chorismate peut être converti en l-phénylalanine, l-tryptophane ou l-tyrosine par les enzymes PheA, TrpE ou TyrA, respectivement. Les délétions des gènes trpE et tyrA peuvent empêcher la perte de carbone dans les voies concurrentes pour la biosynthèse du l-tryptophane et de la l-tyrosine. Enfin, nous avons supprimé le gène pykA dans YHP04 pour obtenir la souche YHP05. Le gène pykA encode la pyruvate kinase A (PykA), qui constitue la deuxième étape consommatrice de PEP. En supprimant le gène pykA, plus de PEP peut être utilisé dans la voie du shikimate et par conséquent, plus de quantité de l-phénylalanine peut être produite. Dans chaque souche (YHP01-YHP05), la délétion des gènes a été vérifiée par PCR et électrophorèse sur gel d’agarose (fichier supplémentaire 3 : figure S3).

Toutes les souches d’E. coli modifiées, y compris YHP01-YHP05 et l’E. coli parentale W3110, ont été cultivées dans des flacons à agitation contenant des milieux semi-définis, et la croissance cellulaire et la production de l-phénylalanine ont été comparées. Après 48 heures de culture, la croissance de toutes les souches modifiées était légèrement supérieure à celle de la souche W3110 ; en particulier, la souche E. coli YHP05 présentait la densité cellulaire la plus élevée (Fig. 4a). Une étude précédente a également observé que l’inactivation des isoenzymes PTS et Pyk augmentait le flux de carbone vers la formation de biomasse en raison de la conservation de quantités réduites de métabolites intermédiaires résultant de la diminution de l’absorption et du catabolisme du glucose. Nous avons également analysé le titre de production de l-phénylalanine dans le surnageant de culture par HPLC. Dans la souche parentale W3110, le titre de production de l-phénylalanine était de 0,24 g/L, mais le titre de l-phénylalanine a progressivement augmenté dans les souches d’E. coli modifiées (Fig. 4a). E. coli YHP05, dans laquelle les gènes crr, tyrR, trpE, tyrA et pykA ont été supprimés, a présenté le titre de production de l-phénylalanine le plus élevé (0,52 g/L), qui était 2,2 fois plus élevé que celui de la souche parentale E. coli W3110. Par conséquent, nous avons décidé d’utiliser la souche E. coli YHP05 pour une ingénierie plus poussée.

Système de surexpression à base de plasmides pour augmenter le pool intracellulaire de l-phénylalanine

En partant de la souche E. coli YHP05, la production de l-phénylalanine a été encore améliorée par la surexpression de gènes à base de plasmides. La rétro-inhibition dans la voie de synthèse de la l-phénylalanine par le shikimate et la l-phénylalanine a été réduite en surexprimant des isozymes ou en introduisant des mutations dans les enzymes impliquées dans la voie du shikimate comme suit : (i) surexpression du gène de la 3-déoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase qui est codé dans aroG avec ingénierie (AroG8/15), (ii) surexpression des gènes ydiB et aroK qui codent la shikimate déshydrogénase et la shikimate kinase pour augmenter le flux de carbone dans la voie du shikimate, (iii) la surexpression du gène pheA codant pour la mutase CHA/préphénate déshydratase avec ingénierie pour l’amélioration de l’affinité de liaison au substrat (PheAfbr, dm), et (iv) la surexpression des gènes galP (galactose perméase) et glk (glucokinase) pour faciliter l’absorption du glucose (Additional file 4 : Figure S4).

Premièrement, pour atténuer l’inhibition de la rétroaction, le plasmide pTac15kG a été construit, qui contenait le gène aroG8/15 modifié. AroG est l’enzyme principale impliquée dans la synthèse de DAHP, mais AroG est complètement inhibée par l-phénylalanine (aussi bas que 0,1 mM) . Il est connu que l’introduction de deux mutations (D146N et A202T) a résulté en une résistance à la rétro-inhibition sans affecter sa haute activité spécifique (AroG8/15), donc nous avons surexprimé cette enzyme mutante AroG8/15. Ensuite, deux plasmides (pTac15kGB et pTac15kGBK) ont été construits pour surexprimer les gènes ydiB et aroK avec le gène aroG8/15, respectivement. Le flux métabolique vers la voie du shikimate peut être augmenté lorsque la shikimate déshydrogénase (YdiB) et la shikimate kinase (AroK) sont surexprimées. De plus, le plasmide pTac15kGBKA a été construit pour surexprimer le gène pheA qui encode la chorismate mutase/prephenate dehydratase avec des mutations. Dans cette construction, nous avons amplifié uniquement les 300 premiers acides aminés de la PheA de type sauvage (PheAfbr), ce qui exclut le domaine de régulation ; par conséquent, la PheAfbr est faiblement influencée par la rétro-inhibition. De plus, comme la valeur du Km de la PheAfbr est plus élevée que celle de la PheA de type sauvage, ce qui reflète sa moindre affinité de liaison au substrat, nous avons introduit deux mutations (E159A et E232A) dans la PheAfbr pour augmenter son affinité de liaison au substrat, ce qui a donné la PheAfbr, dm . Enfin, le plasmide pYHP a été construit pour surexprimer en plus les gènes galP et glk, qui codent respectivement pour la perméase du galactose et la glucokinase. Ces deux enzymes facilitent l’absorption du glucose.

Après la construction de cinq plasmides, dont pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, et pYHP (Tableau 1), chaque plasmide a été transformé dans E. coli YHP05. Après 48 heures de culture dans des flacons agités contenant des milieux semi-définis, la croissance cellulaire et le titre de production de l-phénylalanine ont été analysés. Toutes les cellules se sont bien développées, et en particulier E. coli YHP05 hébergeant pYHP a atteint une densité cellulaire légèrement plus élevée (OD600 = 9,76) que les autres (Fig. 4b). Nous avons également analysé le titre de production de l-phénylalanine dans le surnageant de culture par HPLC. La surexpression du gène aroG8/15 (pTac15kG) a entraîné une augmentation significative de la production de l-phénylalanine (2,25 g/L) par rapport à YHP05 n’hébergeant aucun plasmide (0,52 g/L) (Fig. 4b). La surexpression ultérieure d’autres gènes a entraîné une augmentation en série du titre de production de l-phénylalanine et, E. coli YHP05 hébergeant pYHP a présenté le titre de production de l-phénylalanine le plus élevé (3,91 g/L) (Fig. 4b). L’effet du plasmide pYHP a entraîné une augmentation significative de la production de l-phénylalanine qui a été multipliée par 16,4 et 7,5, respectivement. Dans la culture d’E. coli YHP05 hébergeant pYHP, le rendement en l-phénylalanine sur le glucose et la productivité étaient respectivement de 0,270 g/g et 0,082 g/L/h (fichier additionnel 5 : figure S5). Ainsi, dans l’E. coli YHP05 modifié hébergeant la pYHP, le réservoir de l-phénylalanine a été considérablement amélioré. Liu et al. ont précédemment rapporté que la production de l-phénylalanine dans E. coli atteignait 47 g/L . Cependant, ce record n’a pu être atteint qu’en culture fed-batch (échelle 15 L) et ils ont utilisé la co-expression du transporteur de l-phénylalanine (YddG) pour la production efficace de l-phénylalanine dans le milieu de culture. Dans notre travail, nous n’avons pas introduit le YddG car le but ultime de notre travail n’était pas la production de l-phénylalanine mais la production de cinnamaldéhyde. Bien que le titre de l-phénylalanine obtenu dans notre travail ne soit pas le plus élevé, nous avons pensé qu’il était suffisamment élevé pour la production de cinnamaldéhyde. Par conséquent, nous avons décidé d’utiliser cette souche modifiée pour la production de cinnamaldéhyde.

Production de cinnamaldéhyde dans le E. coli modifié

En utilisant le E. coli modifié YHP05 hébergeant pYHP, nous avons d’abord examiné la production d’acide cinnamique. Pour cette expérience, le plasmide pHB-CA, qui contient le gène SmPAL sous le promoteur trc inductible par l’IPTG, a été construit (tableau 1). E. coli YHP05 hébergeant à la fois pHB-CA et pYHP a été cultivé dans des flacons pendant 48 heures et le titre de production d’acide cinnamique a été analysé. E. coli YHP05 et E. coli W3110 hébergeant pHB-CA (sans pYHP) ont également été examinés comme témoins. Les profils de croissance de toutes les cellules étaient semblables (Fig. 5a) et E. coli W3110 et YHP05 hébergeant le pHB-CA ont produit 79 et 108 mg/L d’acide cinnamique, respectivement (Fig. 5b). E. coli YHP05 hébergeant à la fois le pHB-CA et le pYHP a présenté un titre de production considérablement amélioré (287 mg/L), soit 3,6 fois et 2,7 fois plus élevé que ceux d’E. coli W3110 et de YHP05 hébergeant le pHB-CA, respectivement (Fig. 5b). À notre connaissance, ce titre de production était également 1,5 fois plus élevé que le niveau le plus élevé (186 mg/L) signalé chez E. coli . Ce résultat indique clairement que l’augmentation de la quantité de l-phénylalanine dans la souche d’E. coli modifiée contribue positivement à l’augmentation de la production d’acide cinnamique.

Comme objectif principal, nous avons examiné la production de cinnamaldéhyde dans la souche E. coli YHP05 modifiée, qui a été transformée avec pHB-CAD et pYHP. De plus, E. coli YHP05 et E. coli W3110 hébergeant le pHB-CAD (sans pYHP) ont été examinés comme témoins. La croissance des cellules était similaire (Fig. 6a), et les trois enzymes de biosynthèse du cinnamaldéhyde étaient bien exprimées dans toutes les cellules examinées (Additional file 6 : Figure S6). Après la culture en flacon pendant 48 h, les surnageants de culture ont été recueillis et les titres de production de cinnamaldéhyde ont été déterminés par HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) et E. coli YHP05 (pHB-CAD) ont présenté des titres de production de cinnamaldéhyde aussi élevés que 2,18 et 6,3 mg/L, respectivement (Fig. 6b). Au contraire, E. coli YHP05 (pHB-CAD et pYHP) a présenté un titre de production significativement plus élevé (75 mg/L), qui était 35 fois plus élevé que celui de E. coli W3110 (pHB-CAD).

Activité nématicide du cinnamaldéhyde produit par E. coli modifié

Pour évaluer l’activité nématicide du cinnamaldéhyde produit dans le milieu de culture, des nématodes, B. xylophilus, ont été traités avec du cinnamaldéhyde en suivant les procédures décrites dans « Méthodes » . Le surnageant de culture de E. coli YHP05 hébergeant pYHP et pHB-CAD a été dilué jusqu’à ce que la concentration finale de cinnamaldéhyde soit de 60 mg/L, et les nématodes ont été traités avec le surnageant de culture dilué. Après 1 et 4 heures, seuls 26 % et moins de 18 % des nématodes ont survécu, respectivement (Fig. 7). Comme contrôle positif, les nématodes ont été traités avec du cinnamaldéhyde purifié et disponible dans le commerce à une concentration équivalente (60 mg/L). Après 4 h, presque tous les nématodes (95 %) ont été tués. Ces résultats indiquent que les activités nématicides étaient similaires entre le cinnamaldéhyde acheté dans le commerce et celui produit dans cette étude. Comme contrôle négatif, le surnageant de culture d’E. coli W3110 a également été testé et comme prévu, presque tous les nématodes ont survécu (>92 %) après 4 h.

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