Le MTT, un tétrazole jaune, est réduit en formazan violet dans les cellules vivantes. Une solution de solubilisation (généralement soit du diméthylsulfoxyde, soit une solution d’éthanol acidifié, soit une solution du détergent sodium dodécyl sulfate dans de l’acide chlorhydrique dilué) est ajoutée pour dissoudre le produit de formazan violet insoluble en une solution colorée. L’absorbance de cette solution colorée peut être quantifiée en mesurant à une certaine longueur d’onde (généralement entre 500 et 600 nm) par un spectrophotomètre. Le degré d’absorption de la lumière dépend du degré de concentration de formazan accumulé à l’intérieur de la cellule et à la surface de celle-ci. Plus la concentration de formazan est importante, plus la couleur violette est profonde et donc plus l’absorbance est élevée.
XTT (2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide) a été proposé pour remplacer le MTT, donnant une plus grande sensibilité et une gamme dynamique plus élevée. Le colorant formazan formé est soluble dans l’eau, évitant une étape finale de solubilisation.
Les sels de tétrazolium solubles dans l’eau sont des alternatives plus récentes au MTT : ils ont été développés en introduisant des charges positives ou négatives et des groupes hydroxy sur le cycle phényle du sel de tétrazolium, ou mieux avec des groupes sulfonates ajoutés directement ou indirectement au cycle phényle.
Le MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium), en présence de méthosulfate de phénazine (PMS), produit un formazan dont l’absorbance est maximale à 490 nm dans une solution saline tamponnée au phosphate. Le test MTS est souvent décrit comme un test MTT « en une étape », qui offre la commodité d’ajouter le réactif directement à la culture cellulaire sans les étapes intermittentes requises dans le test MTT. Cependant, cette commodité rend le test MTS sensible aux interférences colométriques, car les étapes intermittentes du test MTT éliminent les traces de composés colorés, alors que ceux-ci restent dans la plaque de microtitration dans le test MTS en une étape. Des précautions sont nécessaires pour garantir la précision de ce test et il existe de solides arguments pour confirmer les résultats du MTS par des observations qualitatives au microscope. (Ceci, cependant, est prudent pour tous les tests colormétriques.)
Les WST (sels de tétrazolium solubles dans l’eau) sont une série d’autres colorants solubles dans l’eau pour les tests MTT, développés pour donner différents spectres d’absorption des formazans formés. Le WST-1 et en particulier le WST-8 (2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium), présentent l’avantage, par rapport au MTT, d’être réduits à l’extérieur des cellules, associés au médiateur électronique PMS, et de donner un formazan hydrosoluble. Enfin, les tests WST (1) peuvent être lus directement (contrairement au MTT qui nécessite une étape de solubilisation), (2) donnent un signal plus efficace que le MTT, et (3) diminuent la toxicité pour les cellules (contrairement au MTT perméable aux cellules, et à son formazan insoluble qui s’accumule à l’intérieur des cellules).