L’une des procédures les plus importantes en virologie est la mesure du titre viral – la concentration de virus dans un échantillon. Une approche largement utilisée pour déterminer la quantité de virus infectieux est le test des plaques. Cette technique a d’abord été développée pour calculer les titres des stocks de bactériophages. Renato Dulbecco a modifié cette procédure en 1952 pour l’utiliser en virologie animale, et elle a depuis été utilisée pour déterminer de manière fiable les titres de nombreux virus différents.
Pour réaliser un essai sur plaque, des dilutions 10 fois plus importantes d’un stock de virus sont préparées, et des aliquotes de 0,1 ml sont inoculées sur des monocouches de cellules sensibles. Après une période d’incubation, pour permettre au virus de se fixer aux cellules, les monocouches sont recouvertes d’un milieu nutritif contenant une substance, généralement de l’agar, qui provoque la formation d’un gel. Lorsque les plaques sont incubées, les cellules infectées d’origine libèrent la progéniture virale. La propagation des nouveaux virus est limitée aux cellules voisines par le gel. Par conséquent, chaque particule infectieuse produit une zone circulaire de cellules infectées appelée plaque. La plaque finit par devenir suffisamment grande pour être visible à l’œil nu. Des colorants qui teintent les cellules vivantes sont souvent utilisés pour renforcer le contraste entre les cellules vivantes et les plaques. Seuls les virus qui causent des dommages visibles aux cellules peuvent être analysés de cette manière. L’image de gauche montre un exemple de plaques formées par le poliovirus sur une monocouche de cellules HeLa. Dans cette image, les cellules ont été colorées avec du cristal violet, et les plaques sont facilement visibles là où les cellules ont été détruites par l’infection virale.
Le titre d’un stock de virus peut être calculé en unités formant des plaques (PFU) par millilitre. Pour déterminer le titre du virus, on compte les plaques. Pour minimiser les erreurs, seules les plaques contenant entre 10 et 100 plaques sont comptées, en fonction de la taille de la plaque de culture cellulaire utilisée. Selon les principes statistiques, lorsque 100 plaques sont comptées, le titre de l’échantillon varie de plus ou moins 10 %. Chaque dilution est ensemencée en double pour améliorer la précision. Dans l’exemple ci-dessous, il y a 17 plaques sur la plaque faite à partir de la dilution 10-6. Le titre du stock de virus est donc de 1,7 x 108 UFP/ml.
Nous verrons ensuite comment le test des plaques peut être utilisé pour préparer des stocks de virus clonaux, une étape essentielle pour étudier la génétique virale.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Quelques problèmes de virologie animale étudiés par la technique de la plaque. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279