DISCUSSION

Citrobacter est une cause importante d’infections opportunistes ; C. diversus est associé à environ 40 % des cas présentés, tandis que C. freundiireprésente environ 29 % (11). Les Citrobacterspp. provoquent des méningites néonatales et ont une propension inhabituelle à provoquer des abcès cérébraux (8, 14). La pathogenèse des Citrobacter spp. qui causent des méningites et des abcès cérébraux n’est pas bien caractérisée ; cependant, comme pour les autres bactéries responsables de méningites, il doit y avoir pénétration de la barrière hémato-encéphalique. La présente étude a été entreprise pour mieux comprendre les interactions potentielles de Citrobacter avec la barrière hémato-encéphalique. C. freundii a été choisie comme bactérie modèle pour ces études car la génétique bactérienne est mieux définie et une bibliothèque génomique est disponible pour d’éventuelles études concernant la base moléculaire de l’invasion et de la réplication de Citrobacter dans les HBMEC. Les expériences réalisées avec un isolat de liquide céphalo-rachidien de C. diversus ont donné des résultats similaires (données non présentées), ce qui suggère que la fréquence et le mécanisme d’invasion des HBMEC pour ces deux espèces peuvent être similaires.

La barrière hémato-encéphalique est une structure complexe qui se compose de l’épithélium des plexus choroïdes et de l’endothélium des capillaires cérébraux. La présence de jonctions serrées et la faible activité pinocytotique des cellules endothéliales entraînent une restriction du passage des macroéléments à travers la barrière hémato-encéphalique. À l’heure actuelle, on ne sait pas à quel endroit de la barrière hémato-encéphalique C. freundii pénètre, mais on a constaté que les plexus choroïdes étaient rarement impliqués dans le modèle de méningite hématogène expérimentale à Citrobacter chez le jeune rat (16). En outre, les cellules microvasculaires endothéliales couvrent la plus grande surface de la barrière hémato-encéphalique, et il a été démontré que d’autres bactéries responsables de méningites envahissent les cellules endothéliales microvasculaires in vitro (13, 20, 25). Nous avons donc choisi les HBMEC pour notre étude. Les essais d’invasion sur culture de tissus et les études TEM ont fourni la preuve que C. freundii envahit les HBMEC. Les résultats des essais d’invasion réalisés en présence de divers inhibiteurs cellulaires eucaryotes suggèrent que l’invasion de C. freundii dans les HBMEC est un processus dépendant des microfilaments, des microtubules, de la synthèse protéique de novo et de l’acidification des endosomes. Des essais d’invasion prolongés ont déterminé que C. freundii peut survivre et se répliquer de façon intracellulaire pendant des périodes prolongées in vitro. Les analyses TEM ont révélé que la localisation intracellulaire des cellules individuelles et multiples de C. freundii se trouve dans des structures de type vacuole à membrane unique. Les expériences Transwell ont démontré que C. freundii pouvait traverser une monocouche polarisée de HBMEC, alors que E. coli non invasif ne le pouvait pas. De plus, nos données préliminaires montrent que C. freundii pénètre la barrière hémato-encéphalique dans le modèle de rat néonatal de méningite hématogène expérimentale (21). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que C. freundii envahit les vacuoles, se réplique éventuellement, transcytose à travers le HBMEC, est libéré dans le côté basolatéral, et pénètre ainsi la barrière hémato-encéphalique.

L’invasion des cellules eucaryotes par C. freundii a été rapportée (22, 35). Cependant, il s’agit du premier rapport sur l’invasion des HBMEC par C. freundii. Curieusement, les exigences eucaryotes pour l’invasion de C. freundii sont aussi diverses que les types de cellules que C. freundii a envahi. Par exemple, il a été démontré que l’inhibiteur de puits recouverts de clathrine MDC inhibe l’invasion de C. freundii dans tous les autres types cellulaires testés (par exemple, les cellules épithéliales vasculaires, intestinales et vésicales humaines) sauf, comme le montre cette étude, dans les HBMEC. En outre, d’autres bactéries responsables de méningites caractérisées jusqu’à présent pénètrent dans les HBMEC par une ou plusieurs voies qui dépendent des microtubules et sont sensibles au MDC (20, 24, 27). Il a été démontré que les inhibiteurs de puits à clathrine MDC et ouabaïne n’inhibent pas tous les récepteurs ; il se peut donc que le récepteur nécessaire à l’invasion de C. freundii dans les HBMEC ne soit pas affecté par l’inhibiteur MDC ou ouabaïne. Bien que les preuves recueillies jusqu’à présent suggèrent que l’entrée de C. freundii dans les HBMEC ne peut pas se produire par une voie médiée par un récepteur sensible au MDC ou à l’ouabaïne, il semble que l’acidification des endosomes et la synthèse de novo des protéines soient toutes deux nécessaires. Les données disponibles suggèrent deux scénarios possibles. L’acidification de l’endosome peut être nécessaire en tant que déclencheur environnemental pour la survie bactérienne intracellulaire. Des exigences similaires ont été caractérisées pour l’invasion épithéliale de Salmonella (26). Alternativement, l’acidification de l’endosome et la synthèse des protéines peuvent être nécessaires pour la séparation du complexe ligand-récepteur, la synthèse du récepteur, et/ou la présentation du récepteur à la surface du HBMEC pour que l’invasion de C. freundii se produise. Ce dernier scénario rappelle celui d’autres pathogènes invasifs, où le contact de l’organisme viable est nécessaire pour la modulation des molécules d’adhésion des cellules eucaryotes qui sont nécessaires à l’invasion (par exemple, Streptococcus pneumoniae et le récepteur du facteur d’activation des plaquettes) (2). Des expériences sont en cours dans notre laboratoire pour distinguer ces scénarios proposés.

Les essais d’invasion réalisés en présence d’inhibiteurs de microtubules (à la fois agents dépolymérisants et stabilisants) diminuent significativement la capacité des HBMEC à absorber C. freundii. Des expériences de microscopie confocale avec des anticorps anti-α-tubuline ont montré que les microtubules s’agrègent après le contact des HBMEC avec C. freundii. L’agrégation des microtubules était un processus dépendant du temps ; aucune agrégation n’a été observée à 5 minutes, peu à 15 minutes, et une agrégation nette a été observée après 30 minutes d’incubation de C. freundii avec les HBMEC. Cette agrégation des microtubules a été inhibée lorsque les cellules ont été traitées avec des inhibiteurs de microtubules ou des agents inhibant les microfilaments. Il est intéressant de noter que le modèle de coloration de l’agrégation des microtubules n’était pas colocalisé avec la liaison bactérienne et que les zones de HBMEC qui ne présentaient pas de liaison avec C. freundii présentaient également un agglutinement prononcé des microtubules. Ceci suggère que le contact de la bactérie avec le HBMEC peut stimuler globalement l’agrégation des microtubules. Il reste à savoir si l’agrégation des microtubules est le résultat d’un facteur bactérien sécrété ou d’une réponse paracrine à la liaison des bactéries aux HBMEC. En outre, l’agrégation des microtubules en réponse à la fixation de C. freundii peut être liée à la présentation postulée du récepteur via la synthèse protéique de novo et l’acidification des endosomes. Il a été démontré précédemment que le transport de nombreux récepteurs vers et depuis la surface cellulaire dépend des microtubules (10). Par conséquent, l’une des explications de l’effet inhibiteur des inhibiteurs de microtubules sur l’entrée de C. freundii dans les HBMEC est que ces agents peuvent diminuer le nombre de récepteurs des HBMEC qui médient l’invasion de C. freundii. Des expériences sont en cours pour discerner entre ces possibilités.

Les microtubules ont précédemment montré qu’ils étaient nécessaires à l’invasion de nombreux agents pathogènes (par exemple, Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, E. coli entéropathogène et entérohémorragique, et Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). L’opinion générale est que, bien que ces agents pathogènes puissent pénétrer par des voies dépendantes des microtubules, ils ne se répliquent généralement pas de manière intracellulaire (6). Les données acquises dans cette étude à partir d’essais d’invasion étendus et d’analyses TEM suggèrent que C. freundii pourrait être une exception à cette généralisation. Contrairement à ce qui a été décrit pour une autre bactérie à réplication intravacuolaire, Legionella pneumophila(12), il n’y a pas eu d’apparition de mitochondries ou de ribosomes à proximité de la bactérie. Cela suggère que C. freundii n’utilise peut-être pas ces organites pour obtenir directement de l’énergie ou que le recrutement de protéines spécifiques de la cellule hôte n’est peut-être pas nécessaire pour la survie et la prolifération intracellulaires (comme dans le cas de L. pneumophila). En ce qui concerne les infections du système nerveux central, d’autres bactéries responsables de la méningite, comme E. coli K1, GBS et S. pneumoniae, ont également envahi (1, 13, 25) ou envahi et transcytosé (20, 27) les BMEC ; cependant, ces organismes ne se sont pas reproduits dans les HBMEC. Comme décrit ci-dessus, la méningite à Citrobacter a été documentée pour sa fréquence élevée de formation d’abcès cérébraux. Il reste à déterminer si la réplication dans les vacuoles des HBMEC est unique pour Citrobacter et s’il existe une corrélation avec la formation d’abcès.

La cytochalasine D inhibe l’invasion de C. freundii dans les HBMEC ; cependant, en utilisant l’immunomarquage, nous n’avons trouvé aucune réorganisation détectable des microfilaments lorsque C. freundii interagit avec les HBMEC (données non présentées). En outre, le prétraitement de HBMEC par la cytochalsine D a inhibé l’agrégation des microtubules dépendante de la bactérie, telle que visualisée par microscopie confocale. Il peut y avoir plusieurs explications à ces résultats. L’effet de la cytochalsine D sur l’agrégation des microtubules dépendante de la bactérie peut être dû à des effets indirects de l’inhibiteur de microfilament sur le réseau de microtubules. Par exemple, on a observé que les microtubules agissent comme des structures d’ancrage pour la F-actine (28). Par conséquent, la perturbation du réseau de microfilaments peut affecter le réseau de microtubules et ainsi affecter indirectement l’invasion de C. freundii dépendante des microtubules dans les HBMEC. Alternativement, une étape d’invasion dépendante de l’actine peut précéder une étape dépendante des microtubules dans l’invasion de HBMEC par C. freundii. Cette étape initiale peut entraîner une réorganisation des microfilaments lorsque les bactéries sont initialement en contact avec le CEBHM ; toutefois, ces événements peuvent être transitoires, et le plan expérimental utilisant la microscopie à immunofluorescence peut ne pas détecter adéquatement leur occurrence. Une situation similaire est observée pour l’invasion médiée par Yersiniainvasin (36). Par conséquent, si les étapes initiales de l’invasion sont empêchées par la cytochalasine D, les étapes ultérieures de l’invasion qui dépendent des microtubules ne sont pas déclenchées. Il a été démontré précédemment que l’actine joue un rôle dans la translocation des facteurs protéiques de liaison à l’actine vers la membrane plasmique ainsi que dans la signalisation cytosolique (19). De plus, la cytochalasine D inhibe l’entrée de Salmonella via la perturbation de la translocation des protéines de liaison à l’actine vers le site d’entrée bactérien (7). Il est possible que dans le cas de l’invasion de C. freundii dans les HBMEC, les microfilaments d’actine soient nécessaires pour la signalisation cytosolique et/ou la pénétration bactérienne au niveau de la membrane plasmique, et que les microtubules soient nécessaires pour le transport des bactéries liées à la membrane depuis la membrane plasmique vers le côté basolatéral (ou juste plus profondément dans la cellule). Ainsi, une perturbation à l’une ou l’autre des étapes de l’invasion entraînerait un  » embouteillage « .

En résumé, les résultats présentés ici indiquent que C. freundii peut envahir, se multiplier à l’intérieur et transcytoser les HBMEC in vitro. La détermination de la base génétique de ces phénotypes fournira un aperçu significatif de la physiopathologie de la Citrobacterméningite et aidera potentiellement à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives. En outre, une analyse comparative moléculaire approfondie de Citrobacter avec d’autres bactéries causant des méningites pourrait faire la lumière sur la propriété unique de Citrobacter de former des abcès cérébraux.

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