Chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans l’analyse alimentaire

La détermination des composés organiques à l’état de traces dans l’analyse alimentaire est d’une importance majeure pour les aspects de qualité et de sécurité alimentaire. Tant la séparation de l’analyte des inférences potentielles dans la matrice alimentaire, que la détermination qualitative et quantitative du composé cible, sont des étapes vitales de la chimie alimentaire analytique.

Définition

La chromatographie liquide (LC, ici High Performance LC – HPLC) est une technique de séparation physique pour l’analyse des traces. Elle est basée sur l’interaction d’un analyte avec une phase stationnaire (colonne avec des particules) et une phase mobile (éluant liquide ou mélange d’éluants). La spectrométrie de masse (MS) est l’outil analytique permettant de mesurer la composition d’un échantillon. La MS génère des informations utiles sur le poids moléculaire et la structure des analytes et aide à l’élucidation de composés inconnus.

La combinaison, LC/MS, LC-MS est une technique puissante, en raison de sa très grande sensibilité (jusqu’à la gamme des ppt) et de sa spécificité. Dans le domaine de l’analyse des traces organiques, la MS est utilisée pour de nombreuses applications, mais contrairement à la GC/MS (chromatographie en phase gazeuse, couplée à la spectrométrie de masse), elle est dédiée à l’analyse des échantillons qui contiennent des cibles analytiques non volatiles, généralement d’une masse comprise entre 200 et 800u, qui sont thermiquement labiles, présentent une polarité élevée ou ont une masse moléculaire élevée.

Principe de fonctionnement

En principe, un appareil LC/MS doit effectuer les quatre étapes de travail, notamment :

1. Séparation chromatographique des analytes par une colonne de séparation
2. Ionisation de l’analyte
3. Isolation des ions et
4. Identification des ions

En général, il n’est pas trivial d’interfacer un système HPLC avec un spectromètre de masse, car la difficulté est de transformer un soluté en un ion en phase gazeuse. La difficulté est de se débarrasser du soluté tout en maintenant un niveau de vide adéquat dans le spectromètre de masse et de générer les ions en phase gazeuse. Par conséquent, les composants qui éluent de la colonne chromatographique sont introduits dans le spectromètre de masse via une interface spécialisée.

Les deux systèmes d’interface d’ionisation les plus utilisés, l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et l’ionisation par électronébulisation (ESI) sont choisis en fonction des propriétés physico-chimiques des analytes (c’est-à-dire la polarité et l’acidité). L’ionisation a lieu à la pression atmosphérique et les deux sont considérées comme une méthode d’ionisation douce, c’est-à-dire que le spectre de masse fournit principalement les informations sur la masse moléculaire, à moins que des techniques de fragmentation ne soient utilisées.

Puisque les composés co-éluent partiellement du système chromatographique, l’affectation claire des fragments individuels ne peut pas être accomplie en utilisant uniquement la LC-MS, où seules les masses des ions moléculaires sont disponibles. Pour surmonter ce problème, on utilise aujourd’hui principalement la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), qui comporte plusieurs étapes de sélection ou d’analyse des masses (LC/MS/MS ou LC/MSn). Ces systèmes sont capables de déterminer des résidus dans la gamme inférieure des ppt. Pour la qualification des molécules organiques, une configuration technique MS différente est nécessaire. Une approche possible pour la qualification est l’utilisation d’un MS qui génère des ions, les conduit vers un piège à ions linéaire et les stocke ensuite dans un champ de radiofréquences. Par la suite, différentes possibilités techniques permettent la qualification des ions et donc, du composé inconnu.

Applications

Depuis son introduction dans l’analyse de routine il y a une dizaine d’années, la LC/MS s’est imposée dans la plupart des domaines de la chimie analytique, par exemple le contrôle qualité, la recherche fondamentale et appliquée et le contrôle gouvernemental.

Les exemples suivants en donnent un bref aperçu:

a) Pharmacie

• Etudes pharmacocinétiques de produits pharmaceutiques, par exemple les processus de dégradation des médicaments
• Développement de médicaments, par exemple. identification de métabolites ou identification d’impuretés

b) Biologie moléculaire

• Protéomique, par exemple étude à grande échelle des protéines, en particulier de leurs structures et fonctions
• Métabolomique, par ex.g. détermination des intermédiaires métaboliques, des hormones et autres molécules de signalisation

c) Environnement

• Eaux usées, par ex. composés endocriniens
• Sol, par ex. organométalliques

d) Alimentation

• Ingrédients, par ex. acides aminés, lipides
• Contaminants, par ex. analyse multi-résidus des pesticides, toxines des fruits de mer, résidus vétérinaires, détermination des colorants, acrylamide, analyse des microcystines
• Produits naturels, par ex. terpènes, stéroïdes

Les tensides perfluorés (PFC) comme exemple dans l’analyse des aliments

Contexte

Les PFC sont un excellent exemple pour combiner une préparation complexe des échantillons avec des dispositifs LC/MS sophistiqués et une connaissance approfondie en chimie analytique. Les propriétés uniques des PFT les rendent utiles dans une gamme de produits industriels et commerciaux, tels que les fluides de refroidissement, les polymères et comme composants dans les produits pharmaceutiques et les pesticides. En particulier, les carboxylates perfluorés (par exemple, l’acide perfluoro-octanoïque – PFOA) et les sulfonates perfluorés (par exemple, l’acide perfluorooctansulfonique – PFOS) sont utilisés comme agents de surface, par exemple pour imprégner les textiles et les tapis, dans les mousses anti-incendie et pour les traitements anti-graisse dans l’industrie du papier. Le PFC est produit depuis plus de 50 ans, et est maintenant distribué dans le monde entier. Si les liaisons C-H ne sont pas entièrement remplacées par des liaisons C-F, l’une des liaisons chimiques les plus fortes connues, une dégradation reste possible.

Seuls l’APFO et le SPFO sont évalués sur le plan toxicologique (toxiques chroniques et cancérigènes), tous les autres composés homologues, isomères etc. ne sont pas encore évalués. D’un point de vue physique, les PFC sont à la fois persistants (c’est-à-dire non dégradables) et mobiles (c’est-à-dire qu’ils peuvent être lessivés des sols contaminés vers les eaux souterraines). Cela représente une menace permanente dans le contexte du captage et/ou du conditionnement de l’eau potable. En outre, les transferts par les plantes introduisent ces composés dans la chaîne alimentaire.

La découverte de niveaux élevés de contamination par les PFC dans deux rivières allemandes en 2006 a attiré l’attention du public sur ces composés.

La pollution de 2006 pourrait provenir de boues organiques, appliquées comme engrais à des fins agricoles. Il a été démontré que le sol contient jusqu’à 600 µg de PFC/kg, provoquant la contamination de l’eau potable et des usines d’approvisionnement. Jusqu’à présent, sept États fédéraux allemands ont signalé une contamination par les PFC.

Fraunhofer IME

L’une des principales compétences du Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology est le développement de méthodes réalisables et fiables pour l’identification et l’analyse des contaminants chimiques dans les aliments et les matrices environnementales.

Depuis 1999, le Fraunhofer IME a mené des projets visant à mesurer la contamination par les PFC dans diverses matrices environnementales. Ces travaux ont été menés pour le compte de partenaires industriels, et se sont concentrés en particulier sur les PFC-carboxylates et les PFC-sulfonates. D’autres enquêtes ont été menées pour le compte du programme de surveillance de la banque fédérale allemande de spécimens environnementaux, qui comprenait également des échantillons de sang humain. En 2005, les premières enquêtes ont été menées dans le domaine des produits alimentaires et en 2006, les résultats de certains échantillons alimentaires (par exemple, le lait maternel, les frites) ont également été discutés dans les médias. Des projets plus importants axés sur le transfert de plantes, la pomme de terre et les produits, les matrices humaines (sang et lait maternel), ainsi que les échantillons environnementaux (par exemple, les eaux usées, les boues et le sol) ont été menés en 2007.

Solution analytique

Trois préparations d’échantillons différentes ont été appliquées pour couvrir toutes les matrices d’échantillons possibles:

• IPE (Ion pair extraction). Utilisation d’un agent de pairage ionique, l’hydrogénosulfate de tétra-n-butylammonium, suivi d’une extraction liquide-solide (par exemple, des échantillons environnementaux)
• AAE (extraction acide-alcaline). Élimination des lipides avec de l’hexane à pH 14 (solution liquide d’ammoniac), ajustement à pH 1 avec de l’acide chlorhydrique et extraction avec de l’éther tert-butylméthylique (par exemple lait maternel)
• SPE (extraction en phase solide, méthode actuellement la plus citée) avec des cartouches de polarité différente selon le caractère ionique du PFC dans un milieu tamponné (par ex.par exemple la pomme de terre)

L’utilisation de standards internes pour la calibration est fortement recommandée ; actuellement, nos méthodes incluent neuf standards de PFC marqués en masse. Avant d’introduire les échantillons dans le LC/MS, il faut vérifier que l’appareil lui-même ne contient pas de pièces détachées recouvertes de téflon, car elles contiennent des PFC émetteurs qui influenceront les résultats de manière non reproductible. Ces pièces doivent être remplacées ce qui nécessite une connaissance supérieure des composants du LC/MS.

Exemple analytique

Pour les analyses de la pomme de terre crue et des produits à base de pomme de terre, nous avons ajusté notre LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 avec Quattro Ultima Pt en mode Electrospray négatif, les deux Waters ; colonne C18(2) 150 x 2 mm Luna 3 µm, Phenomenex) pour les masses cibles de 9 acides perfluorocarboxyliques (C4 – C12) et 3 acides perfluorosulfoniques (C4, C6, C8) en utilisant des matériaux de référence marqués au 13C (LOQ 0.5 µg/Kg) après une préparation d’échantillon SPE.

Les PFC ont montré une distribution différente dans la pomme de terre crue et dans les produits à base de pomme de terre, (Tableau 1) ce qui permet de supposer une contamination pendant la transformation, ainsi qu’une contamination du sol. Cela peut être soutenu par nos enquêtes de 2006 sur les frites PFC, où nous avons analysé des frites provenant de restaurants de restauration rapide et avons trouvé jusqu’à 2,8 µg PFOA/kg et jusqu’à 0,9 µg PFOS/kg.

Perspectives analytiques

Le Fraunhofer IME a une expertise et une expérience significatives dans l’analyse des PFC, qui pourraient être appliquées à de nombreux domaines de la contamination PFC environnementale / alimentaire qui n’ont pas encore été étudiés. Les domaines importants pour la recherche future sur les PFC peuvent inclure l’augmentation du nombre d’analytes, de nombreux PFC à chaîne courte et longue sont déjà inclus dans notre programme d’étude, mais notre capacité analytique pourrait être améliorée en incluant des PFC supplémentaires. Les PFC supplémentaires doivent être identifiés par LC/MS car les normes commerciales ne sont pas disponibles. Cela conduira à des résultats consolidés sur les précurseurs, les voies de contamination des aliments et la dégradation pendant le traitement des aliments.

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