Une suspension de résine, comme le DEAE-Sephadex, est versée dans la colonne. La matrice utilisée est insoluble avec des groupes chargés qui sont attachés de manière covalente. Ces groupes chargés sont appelés des échangeurs comme les échangeurs de cations et d’anions. Après la décantation, la colonne est prééquilibrée dans un tampon avant l’application du mélange de protéines. Le DEAE-Sephadex est une suspension chargée positivement qui aura des interactions électrostatiques avec les atomes chargés négativement, les faisant éluer plus tard que les molécules chargées positivement dans l’échantillon intéressé. Il s’agit d’une technique de séparation largement utilisée pour découvrir des protéines spécifiques, ou des enzymes dans le corps. Les protéines non liées sont recueillies dans l’écoulement et/ou dans les lavages tampons ultérieurs. Les protéines qui se lient à la résine chargée positivement sont retenues et peuvent être éluées de deux manières. Premièrement, la concentration en sel du tampon d’élution est progressivement augmentée. Les ions négatifs de la solution saline (par exemple, Cl-) entrent en compétition avec les protéines pour se lier à la résine. Deuxièmement, le pH de la solution peut être progressivement diminué, ce qui entraîne une charge plus positive sur la protéine, la libérant de la résine. Ces deux techniques peuvent déplacer la protéine chargée négativement qui est alors éluée dans des fractions de tubes à essai avec le tampon.
La séparation des protéines va dépendre des différences de charge totale. La composition des groupes de chaînes latérales ionisables va déterminer la charge totale de la protéine à un pH particulier. Au point isoélectrique (pI), la charge totale de la protéine est de 0 et elle ne se lie pas à la matrice. Si le pH est supérieur au pI, la protéine aura une charge négative et se liera à la matrice dans une colonne d’échange d’anions. La stabilité de la protéine à des valeurs supérieures ou inférieures au pI déterminera si une colonne d’échange d’anions ou une colonne d’échange de cations doit être utilisée. Si elle est stable à des valeurs de pH inférieures au pI, la colonne d’échange de cations sera utilisée. Si elle est stable à des valeurs de pH supérieures au pI, on peut utiliser la colonne d’échange d’anions.