Évolution de la spécificité de séquence dans une endonucléase de restriction par une mutation ponctuelle

Résultats et discussion

Deux modes de clivage de l’ADN par R.KpnI en présence de Mg2+.

R.KpnI est une REase hautement promiscuous dans les réactions catalysées par le Mg2+, contrairement à la plupart des autres REases (11, 12). Dans la figure 1 A, le schéma de clivage caractéristique par R.KpnI est montré dans une gamme de concentrations de Mg2+. À des concentrations plus faibles de l’ion métallique (50-500 μM), seul le clivage de la séquence cognée a été observé (voies 2-5). Cependant, à des concentrations de Mg2+ >500 μM, un clivage promiscuous était évident (voies 6-9). Les modes spécifiques et promiscuous de clivage par R.KpnI en fonction de la concentration en Mg2+ ont été corroborés par l’analyse du clivage d’oligonucléotides. Le substrat oligonucléotidique contenant la séquence canonique a été clivé efficacement par la R.KpnI même à 20 μM Mg2+. En revanche, les séquences non canoniques ont été efficacement clivées uniquement à >500 μM Mg2+ . Ces résultats impliquent que la R.KpnI présente deux profils d’activation métallique différents – l’un pour les substrats d’ADN canoniques et l’autre pour les noncanoniques. L’enzyme suit un profil d’activation métallique hyperbolique pour le substrat canonique et un modèle sigmoïdal pour le substrat non canonique (Fig. 1 B). Ces données ont été soumises à une analyse du tracé de Hill (Fig. S2 ; et voir le texte SI), et le coefficient de Hill pour la liaison des ions métalliques est présenté dans le tableau 1. L’analyse du graphique de Hill a révélé la liaison d’un ion métallique supplémentaire à l’enzyme et son rôle dans le clivage des séquences non canonique. Ainsi, le recrutement d’un ion métallique supplémentaire à proximité ou à distance du site actif de l’enzyme semble être nécessaire pour induire un clivage promiscuous par l’enzyme. Si tel est le cas, la mutation des résidus impliqués dans la coordination de l’ion métallique du second site devrait abolir l’activité promiscuous, ce qui donnerait lieu à une enzyme hautement spécifique à la séquence. Nous avons testé cette hypothèse.